При каком способе получения генов используется фермент обратная транскриптаза

Использование обратной транскриптазы

Задача синтеза гена значительно упростилась с открытием фермента обратной транскриптазы, обнаруженной впервые у РНК-содержащих ретровирусов. Ретровирусы используют обратную транскриптазу для синтеза ДНК-овой копии собственной РНК. Образующаяся при этом двухцепочечная молекула ДНК может легко интегрироваться в геном клетки-хазяина. В 1970 г. Темин и Митузани и независимо от них Балтимор выделили данный фермент из препарата внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. По механизму действия этот энзим является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, но чаще используются его тривиальные названия – обратная транскриптаза или ревертаза.

Обратная транскриптаза обладает по крайней мере тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) Активностью РНК-азы Н, гидролизующей цепь РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза очевидно участвует в интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.

В генной инженерии обратную транскриптазу используют для получения ДНК-овой копии гена, если удается выделить из донорной клетки соответствующую гену m-РНК (матричную, информационную РНК).

Синтез гена с помощью ревертазы ведут таким образом: сначала в систему вводят m-РНК, набор ДНК-овых нуклеотидов, небольшие затравки для синтеза – праймеры – олиго (dT) и обратную транскриптазу, которая начинает синтезировать на матрице m-РНК комплементарную цепь ДНК; затем с помощью щелочного гидролиза удаляют m-РНК, а обратная транскриптаза «делает разворот», и используя только что образованную цепь ДНК как матрицу, синтезирует на ней еще одну комплементарную цепь. Для ускорения синтеза второй цепи ДНК на этой стадии иногда добавляют ДНК-полимеразу I E. coli, которая дублирует полимеризующую активность ревертазы. По окончании синтеза первая и вторая цепи ДНК оказываются связанными петлей в виде шпилечной структуры. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S 1, которая способна специфически гидролизовать одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. В результате получают полноценную ДНК-овую копию гена, которую можно легко встроить в вектор и ввести в клетку-реципиента.

Однако при использовании ревертазы есть свои сложности. Так, m-РНК не содержит регуляторных участков (промоторов и терминаторов), что вызывает необходимость достраивать их в векторе. Кроме того, выделить m-РНК в чистом виде достаточно сложно.

Метод дробовика (дробового ружья)

При невозможности синтезировать ген химическим путем или с помощью обратной транскриптазы используют технику Shot-gun – метод дробового ружья. Суть его заключается в том, что сначала ДНК дробят на фрагменты с помощью рестриктаз, то есть создают библиотку генов или фрагментов ДНК. Полученные ДНК-овые фрагменты гибридизируют «вслепую» с вектором, разрезаным той же рестриктазой. Гибридные векторы, содержащие встроенный ген методом трансформации переносят в бактерии (обычно в кишечную палочку) и размножают. Затем идентифицируют и отбирают необходимые колонии одним из перечисленных ниже методов (см. IV этап). Способ отбора на селективных средах осуществляют с помощью генетических маркеров – способности расти на средах с антибиотиком, если ген несет фактор устойчивости, неспособности расти на средах с антибиотиком, если ген устойчивости к этому антибиотику инактивирован путем встройки в него гибридного фрагмента (при этом используется метод реплик), способности расти на средах без ауксина, если в геном ауксотрофа по этому ауксину введен нужный ген. Если же соответствующий генетический маркер не найден, используют метод гибридизации.

Дата добавления: 2015-08-08 ; просмотров: 1259 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза (также известная как ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза) — фермент (КФ 2.7.7.49), катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе, называемом обратной транскрипцией.

Называется так потому, что большинство процессов транскрипции в живых организмах происходит в другом направлении, а именно, с молекулы ДНК синтезируется РНК-транскрипт.

Обратная транскриптаза была открыта Говардом Теминым в Университете Висконсин-Мэдисон и независимо Дэвидом Балтимором в 1970 году в Массачусетском технологическом институте. Оба исследователя получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины в 1975 году совместно с Ренато Дульбекко.

Содержание

Значение для вирусов

Обратная транскрипция необходима, в частности, для осуществления жизненного цикла ретровирусов, например, вирусов иммунодефицита человека и T-клеточной лимфомы человека типов 1 и 2. После попадания вирусной РНК в клетку обратная транскриптаза, содержащаяся в вирусных частицах, синтезирует комплементарную ей ДНК, а затем на этой цепи ДНК, как на матрице, достраивает вторую цепь.

Значение для эукариот

Ретротранспозоны эукариот кодируют обратную транскриптазу, которая используется ими для встраивания в геном хозяина подобно тому, как это происходит у вирусов. Обратной транскриптазой является также теломераза.

Роль в генетической инженерии

В генетической инженерии обратную транскриптазу используют для получения кДНК — копии эукариотического гена, не содержащей интронов. Для этого из организма выделяют зрелую мРНК, кодирующую соответствующий генный продукт (белок, РНК) и проводят с ней в качестве матрицы обратную транскрипцию. Полученную кДНК можно трансформировать в клетки бактерий для получения трансгенного продукта.

См. также

В этой статье не хватает ссылок на источники информации.

Wikimedia Foundation . 2010 .

Полезное

Смотреть что такое «Обратная транскриптаза» в других словарях:

Обратная транскриптаза — (ревертаза, РНК зависимая ДНК полимераза) фермент, осуществляющий образование ДНК копии у РНК геномных вирусов. Встречается у некоторых РНК вирусов, имеющих однонитчатый негативный геном. Обеспечивает возможность интеграции РНК генома вирусов в… … Словарь микробиологии

обратная транскриптаза — обратная транскриптаза. См. ревертаза. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

обратная транскриптаза — РНК зависимая ДНК полимераза [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN reverse transcriptase … Справочник технического переводчика

Обратная транскриптаза ВИЧ — Обратная транскрипция это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так передача генетической информации при этом происходит в «обратном» направлении, относительно… … Википедия

Обратная транскриптаза РНК-зависимая ДНК-полимераза ревертаза — Обратная транскриптаза, РНК зависимая ДНК полимераза, ревертаза * зваротная транскрыптаза, РНК залежная ДНК полімераза, рэвертаза * reverse transcriptase or PTase or RNA dependent DNA polymerase ретровирусный многофункциональный фермент класса… … Генетика. Энциклопедический словарь

Транскриптаза обратная РНК-зависимая ДНК-полимераза ревертаза — Транскриптаза обратная, РНК зависимая ДНК полимераза, ревертаза * транскрыптаза зваротная, РНК залежная ДНКполімераза, рэвертаза * reverse transcriptase … Генетика. Энциклопедический словарь

Обратная транскрипция — Обратная транскрипция это процесс образования двуцепочечной ДНК на матрице одноцепочечной РНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией, так как передача генетической информации при этом происходит в «обратном», относительно… … Википедия

транскриптаза обратная — см. ревертаза. (Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.) … Словарь микробиологии

транскриптаза обратная — (син. ревертаза) фермент, катализирующий обратную транскрипцию рибонуклеиновой кислоты вирусов (в т. ч. опухолевых) в участки дезоксирибонуклеиновой кислоты (гены) … Большой медицинский словарь

Транскриптаза Обратная (Reverse Transcriptase) — присутствующий главным образом в ретровирусах фермент, который катализирует синтез молекул ДНК из РНК. Наличие этого фермента способствует соединению вирусной РНК с молекулами ДНК клеток хозяина. Источник: Медицинский словарь … Медицинские термины

Источник

ОБРА́ТНАЯ ТРАНСКРИПТА́ЗА

В книжной версии

Том 23. Москва, 2013, стр. 537

Скопировать библиографическую ссылку:

• 
• 
• 
• 
• 

ОБРА́ТНАЯ ТРАНСКРИПТА́ЗА (РНК-за­ви­си­мая ДНК-по­ли­ме­ра­за), фер­мент клас­са транс­фе­раз, ка­та­ли­зи­рую­щий об­рат­ную транс­крип­цию – син­тез ДНК по мат­ри­це РНК. Впер­вые об­на­ру­же­на в 1970 в со­ста­ве рет­ро­ви­ру­сов Х. Те­ми­ном и С. Ми­зу­та­ни и не­за­ви­си­мо Д. Бал­ти­мо­ром (все – США). Бла­го­да­ря от­кры­тию О. т. центр. дог­ма мо­ле­ку­ляр­ной био­ло­гии (на­след­ст­вен­ная ин­фор­ма­ция пе­ре­да­ёт­ся от ДНК к бел­ку, но не в об­рат­ном на­прав­ле­нии) ос­та­лась не­по­ко­леб­лен­ной, но по­лу­чи­ла бо­лее ши­ро­кое тол­ко­ва­ние: ин­фор­ма­ция пе­ре­да­ёт­ся от лю­бой фор­мы нук­леи­но­вой ки­сло­ты (ДНК и РНК) к бел­ку, но не в об­рат­ном на­прав­ле­нии. В нач. 1980-х гг. вы­яс­ни­лось, что в струк­ту­ре мн. мо­биль­ных ге­не­тич. эле­мен­тов эу­ка­ри­от есть ген, ко­ди­рую­щий О. т., и не­ко­то­рые псев­до­ге­ны (напр., гло­би­нов) и ко­рот­кие мо­биль­ные ге­не­тич. эле­мен­ты об­ра­зу­ют­ся пу­тём об­рат­ной транс­крип­ции по мат­ри­це их мРНК. Ока­за­лось так­же, что в ге­но­мах ДНК-со­дер­жа­щих ге­пад­на­ви­ру­сов (в т. ч. ви­ру­са ге­па­ти­та В) и ви­ру­са мо­заи­ки цвет­ной ка­пус­ты (CaMV) есть уча­ст­ки, имею­щие сход­ст­во с ге­ном, ко­ди­рую­щим О. т. у рет­ро­ви­ру­сов.

Источник

«Швейцарский нож» вирусной армии: разгадан секрет обратной транскриптазы

Схема эксперимента, основанного на измерении резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) и позволяющего определить ориентацию одиночной молекулы обратной транскриптазы (ОТ). Субстраты ОТ, представляющие собой различные гетеродуплексы РНК и ДНК, ковалентно присоединены к кварцевой подложке и помечены флуоресцентным красителем Cy5 (красные звезда и круги); РНКазный домен ОТ (H-домен) помечен красителем Cy3 (зелёные звезда и круги). В такой схеме, измерение флуоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО) позволяет следить за ориентацией молекулы ОТ в пространстве. Звёзды означают излучающую молекулу флуорофора, круги — неизлучающую.

Автор

Редакторы

Обратная транскриптаза — фермент, представляющий самую сущность ретровирусов, таких как ВИЧ. Он обладает двумя различными каталитическими активностями и имеет сродство к нескольким формам нуклеиновых кислот, — гетеродуплексам из ДНК и РНК. С помощью оригинальной методики, позволяющей следить за ориентацией одной-единственной молекулы этого фермента, учёные описали поведение обратной транскриптазы и «засекли» его переключение между разными формами.

Для саморепликации в клетке-«хозяине» ретровирусы, такие как ВИЧ, должны создать двуцепочечную ДНК-копию своего одноцепочечного РНК-генома. В результате этого элегантного, хотя зачастую и смертельно опасного процесса, один из важнейших ретровирусных ферментов — обратная транскриптаза (ОТ), или ревертаза, — синтезирует цепочку длиной ≈20 000 нуклеотидных пар, а поток генетической информации при этом противоположен «общепринятому» (ДНК→РНК). ОТ является излюбленной мишенью для разработчиков противовирусных препаратов — как минимум половина выпускаемых средств, нацеленных на излечение СПИДа, направлена именно на этот белок. Процесс обратной транскрипции весьма сложен — ведь ферменту приходится работать с несколькими различными формами одно- и двуцепочечных РНК и/или ДНК, различать их между собой и «переключаться» в нужный режим — дело непростое. И вот в журнале Nature за авторством Аббонданзиери (Abbondanzieri) и его коллег вышла работа, описывающая, как обратной транскриптазе удаётся различить между собой различные субстраты на промежуточных этапах обратной транскрипции [1].

Рисунок 1. Обратная транскриптаза (ОТ) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) преобразует одноцепочечный РНК-геном вируса в двуцепочечную молекулу ДНК. А. Для синтеза первой («минусовой») цепи ДНК фермент использует в качестве праймера молекулу транспортной РНК (тРНК) из клетки «хозяина», присоединяясь к 3′-концу тРНК полимеразным (P) доменом. Б. После того, как «минусовая» цепь ДНК уже синтезирована, ОТ расщепляет РНК-«матрицу», связываясь с дуплексом РНКазным (H, от термина RNase H) доменом, оставляя тем не менее не тронутыми полипуриновые тракты (ППТ). В. Для синтеза второй («плюсовой») цепи ДНК ОТ использует оставшиеся ППТ в качестве праймеров, опять соединяясь с дуплексом в полимеразном режиме.

Обратная транскриптаза обладает двумя различными ферментативными активностями: ДНК-полимеразной, «копируя» РНК- или ДНК-шаблон в комплементарную ДНК-цепь, и активностью РНКазы H, катализируя расщепление цепи РНК в составе РНК/ДНК дуплекса на маленькие фрагменты — после того, как она уже послужила матрицей для синтеза первой («минусовой») цепи ДНК (см. рис. 1). Однако некоторые фрагменты РНК — называемые полипуриновыми трактами (ППТ) — фермент «пропускает», не допуская их деградации. Последовательность и структура этих участков довольно необычна, что, видимо, и позволяет им остаться незамеченными белками семейства РНКаз H [2].

Как и другие ДНК-полимеразы, ОТ начинает синтез ДНК с праймеров — коротких фрагментов нуклеиновых кислот, которые образуют как бы «затравку» для синтеза парной цепи. Для синтеза «минусовой» цепи ДНК ОТ использует в качестве праймера присутствующие в заражённых клетках молекулы транспортной РНК (тРНК). Для образования второй («плюсовой»), комплементарной первой, цепи фермент использует ППТ-фрагменты, оставшиеся от расщепления РНК-«матрицы» после работы ОТ в РНКазном режиме (рис. 1б).

Детали взаимодействий обратной транскриптазы ВИЧа с различными субстратами на молекулярном уровне были выяснены ранее путём анализа структур ОТ в комплексе с различными дуплексами нуклеиновых кислот — ДНК/ДНК и РНК/ДНК [2], [3]. Также было изучено поведение фермента, связывающегося с комплексом ДНК/ДНК в присутствии дезоксирибонуклеотидов — «строительных блоков» ДНК, выстраиваемых ДНК-полимеразой в комплементарную цепочку и сшиваемых между собой [4]. В результате этих структурных и биохимических экспериментов удалось показать, что ОТ взаимодействует как с обеими молекулами нуклеиновой кислоты в составе дуплекса, так и со «свободными» нуклеотидами; при этом её полимеразный (P) сайт связывает 3′-конец праймера. В режиме же расщепления РНК фермент взаимодействует с комплексом РНК/ДНК, и его H-каталитический домен связывается с цепью РНК [2] (рис. 1). Однако невыясненным оставалось то, как обратная транскриптаза отличает ППТ-фрагменты цепи РНК в качестве праймера для синтеза «плюсовой» ДНК-цепочки от остальной последовательности РНК, уже использованной в качестве матрицы, и расщепляемой в РНКазном режиме.

В статье Аббонданзиери [1] приведены удивительные данные о механизмах взаимодействия обратной транскриптазы с различными нуклеиновыми кислотами и их дуплексами. Для определения ориентации одиночной (!) молекулы ОТ по отношению к связанному РНК/ДНК гибриду, учёные использовали измерения резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между различными молекулами-флуорофорами, которыми помечали как фермент, так и субстрат (см. картинку в заглавии). В отличие от типичных биохимических экспериментов, изучающих популяции молекул и их комплексов, спектроскопические методики вроде FRET позволяют непосредственно наблюдать за одиночными молекулярными событиями в реальном времени. Для анализа FRET две интересующие исследователей молекулы — в данном случае, обратную транскриптазу и нуклеиновую кислоту, — помечают флуоресцирующими химическими группами, миграция флуоресцентной энергии между которыми зависит от расстояния и может использоваться для оценки межмолекулярных взаимодействий.

Исследователи обнаружили, что если обратная транскриптаза связывается с дуплексом, состоящим из сравнительно длинной (≈50 нуклеотидов) цепи ДНК (соответствующей «минусовой» цепи), и довольно короткого сегмента РНК (соответствующего остатку «матрицы»), фермент переходит в РНКазный режим. При этом полимеразный домен остаётся не задействованным, не связывая свободный 3′-конец РНК-сегмента. Однако если молекула РНК представляет собой полипуриновый тракт (ППТ), Р-домен активизируется и связывается с 3′-концом ППТ-сегмента в готовности удлинять его, синтезируя «плюсовую» цепь ДНК (рис. 2).

Рисунок 2. Будучи частью РНК вирусного генома, полипуриновый тракт (ППТ) служит шаблоном для синтеза «минусовой» цепи ДНК. А. До расщепления РНК ППТ-сегментов обратная транскриптаза связывается с последовательностью ППТ (синим цветом) в режиме РНКазы H (т.е. H-домен ОТ находится в непосредственной близи 3′-конца ППТ, показанного кругом), предотвращая связывание P-домена и преждевременный синтез ДНК. Б. Когда вся РНК по соседству с ППТ «выщеплена», позволяя ППТ-последовательности выступать в роли праймера, ОТ связывается с дуплексом в полимеразном режиме (когда P-домен оказывается вблизи 3′-конца ППТ), чтобы запустить синтез «плюсовой» цепи. Видимо, обратная транскриптаза ВИЧа спонтанно «переключается» между этими режимами связывания и, соответственно, функциями.

В работе также показано, что в присутствии свободных нуклеотидов доля молекул ОТ, связанных с ППТ-праймером в полимеразном режиме, возрастает. Более того, если в качестве праймера для «плюсовой» цепи выступает ДНК-последовательность, подавляющая доля молекул обратной транскриптазы «переключается» в режим полимеразы. Эти результаты наглядно показывают, что специфическое строение ППТ-сегментов не столько защищает их от расщепления, сколько образует эффективный праймер для полимеризации второй цепочки ДНК.

Что особенно интересно, обратная транскриптаза может, по видимому, «перескакивать» из одной ориентации по отношению к дуплексу в другую — и это без необходимости диссоциации комплекса. Этот переход оказался довольно неожиданным, особенно если учитывать сложную картину межмолекулярных взаимодействий фермент–субстрат. Кроме того, учёным удалось выяснить, что свободные нуклеотиды могут связываться с ОТ в комплексе с дуплексом, где праймер замещен химически-модифицированным «терминирующим» олигонуклеотидом, не способным к элонгации, стабилизируя «полимеразную» ориентацию фермента в составе комплекса. Образование таких «тупиковых» комплексов уже описывалось ранее [5] в контексте затруднения разблокировки терминирующих олигонуклеотидов и превращения их в обычные праймеры.

В работе было сделано и ещё одно важное наблюдение: невирапин (nevirapine) — противовирусный препарат, связывающийся в основании субдомена «большого пальца» обратной транскриптазы ВИЧа (рис. 2а) и ингибирующий фермент, — увеличивает частоту переходов ОТ между «полимеразной» и «РНКазной» ориентациями фермента в составе комплекса с гетеродуплексом РНК/ДНК. Это взаимодействие, меняющее сродство разных форм фермента к субстрату, может лежать в основе механизма действия подобных препаратов, — что уже, впрочем, обсуждалось и ранее [6], [7].

Работа Аббонданзиери наглядно показывает необходимость понимания того, как ориентационная динамика обратной транскриптазы связана с активностью этого белкá. Их открытие, кроме того, ставит вопрос, не возникает ли примеров подобной «молекулярной акробатики» на более ранних этапах работы ОТ — при связывании тРНК в качестве праймера для синтеза «минусовой» ДНК-цепи? Другой вопрос — для всех ли ферментов, обладающих более чем одной функцией, характерно такое ориентационное поведение? В качестве примеров подобных белков можно привести ДНК-полимеразу, которая, помимо своей основной функции, имеет и неполимеразную активность, или другие ферменты, «должности» которых связаны с нуклеиновыми кислотами, — хеликазы, лигазы, топоизомеразы, интегразы и эндонуклеазы рестрикции. Какими бы не были ответы на эти вопросы, относительно обратной транскриптазы уже понятно, что этот фермент оказался намного более «гибким» в работе с нуклеиновыми кислотами, чем можно было предположить ранее.

Источник