Значение спор бактерий способы окрашивания

Споры:значение, методы окраски.

Споры бактерий представляют собой бактериальные клетки в состоянии анабиоза и образуются при неблагоприятных условиях внешней среды.

Располагаться могут внутри клетки терминально , субтерминально или центрально.

В процессе спорообразования клетка почти полностью теряет воду, смарщивается, клеточная стенка уплотняется, появляется новое вещество дипиколинат кальция которое образует комплексы с биополимерами клетки, устойчивые к действию температуры и ультрофиолетовых лучей. В окружающей среде споры бактерий могут сохраняться годами, но при попадании в благоприятные условия спора впитывает влагу, комплексы распадаются, дипиколинат разрушается и спора превращается в вегетативную клетку.

Таким образом, спору следует рассматривать не как способ размножения клетки(как это часто имеет место у грибов ), а только как способ существования бактериальной клетки в неблагоприятных условиях. При этом надо запомнить – 1 клетка- 1спора- 1 клетка. 5

Спорообразование характерно в основном для Гр(+) бактерий. У Гр(-) эквивалентом спорообразования является переход в так называемое некультивируемое состояние.

У таких бактерий метаболизм снижен, в силу чего они теряют способность к размножению и не растут на питательных средах. Однако в этой форме бактерии сохраняют свою верулентность и, попадая в макроорганизм, они восстанавливают свою активность.

Этот процесс детерминирован на генетическом уровне. Основную роль играют трансмембранные сенсорные белки, которые улавливают изменение в окружающей среде и передают на соответствующий ген. От активности последних будет зависеть переход в некультивируемую форму.

В такой форме они могут длительно сохраняться в окружающей среде.

Два семейства образуют споры:

А)возбудитель сибирской язвы.

Б)Возбудитель столбняка, ботулизма, газовой гангрены.

При окраске по Граму споры не видно, а наличие можно заподозрить, если в клетке есть пустоты.

Далее применяется специальный метод окраски по Клейну:

1)Для размягчения применяем карболовый фуксин и температуру.

3)Берем мителеновый синий- в результате полюса получаются синими, а спора красной.

Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму.

Рабочая тетрадь-11-12 стр .

Некультивируемые формы бактерий. Методы их выявления.

У многих видов Гр(-) бактерий существует особое приспособительное, генетически регулируемое состояние, эквивалентное цистам, в которое они могут переходить под влиянием неблагоприятных условий и сохранять свою жизнеспособность до нескольких лет. Главная особенность такого состояния в том, что бактерии в нем не размножаются и не образуют колоний на питательной среде. Такие неразмножающиеся, но жизнеспособные бактерии и называются некульвируемыми формами бактерий (НФБ).Клетки этих бактерий находятся в метаболически активном состоянии, они высокоустойчивы к воздействию условиям внешней среды.

Для их обнаружения используют методы молекулярно-генетического анализа (ДНК-гибридизацию, ПЦР).

Понятие о метаболизме. Анаболизм и катаболизм. Особенности метаболизма бактерий.

Метаболизм бактерий представляет собой совокупность двух противоположных, но взаимосвязанных процессов — катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (диссимиляция) — распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.

Анаболизм (ассимиляция) — синтез веществ с затратой энергии.

Изучают метаболизм бактерий с помощью биохимических и физико- химических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на питательных средах, содержащих определенные субстраты.

Особенности метаболизма у бактерий.

1) Процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;

2)Высокая интенсивность процессов метаболизма, обусловленная тем, что соотношение поверхности к единице массы больше, чем у многоклеточных;

3)Субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк — от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества — загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым ее самоочищение).

4)Бактерии имеют очень широкий набор ферментов — это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов.

Методы изучения метаболизма бактерий.

— определение продуктов метаболизма, которые накапливаются в питательной среде;

— определение продуктов метаболизма, которые накапливаются в самой бактериальной клетке.

Обмен веществ у бактерий может протекать только с помощью ферментов. У бактерий обнаружено более 1000 ферментов.

Ферменты бактерий по локализации делятся на:

— экзоферменты, которые выделяются во внешнюю среду;

— эндоферменты – работают в клетке.

Конститутивные и индуцибельные ферменты бактерий. Автоматическая регуляция синтеза ферментов.

Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т.е. для одних – репрессируется , а для других – индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде, называется индуцибельными. Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными. Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях.

Регуляция синтеза ферментов подчинена:

Подавляются или активируются не ферменты, а гены, отвечающие за их синтез.

Информация о синтезе белка посылает структурный ген, который находится под действием ген-оператора. Ген-оператор находится под действием ген-регулятора. В активном состоянии ген-регулятор посылает в клетку информацию и начинает вырабатываться вещество репрессор. Он блокрует ген-оператор и поэтому структурный ген не работает.

По этому механизму синтез большинства веществ подавлен. Если во внешней среде появляется субстрат, то считается, что он взаимодействует с репрессором. Таким образом ген-оператор не блокируется и в клетку идет информация о синтезе фермента.

Этот механизм лежит в основе синтеза индуцибельных ферментов.

В ряде случаев может происходить мутация либо гена-оператора, либо ген-регулятора и ферменты начинают вырабатываться постоянно.

Типы питания бактерий. Классификация бактерий по источникам углерода и азота.

По типу питания, т.е. в зависимости от характера источника получения углерода и азота микроорганизмы делятся на аутотрофы и гетеротрофы.

Аутотрофы используют в качестве получения углерода и азота неорганические вещества

Гетеротрофы – используют в качестве получения углерода и азота органические вещества.

В свою очередь, гетеротрофы делятся на паратрофов (источник питательных веществ – объекты живой природы) и метатрофы (источник питательных веществ – органические вещества неживой природы).

Прототрофы – это микроорганизмы, способные самостоятельно синтезировать все необходимые органические соединения.

Ауксотрофы – это микроорганизмы, не способные самостоятельно синтезировать необходимые соединения; они получают их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина.

Источники азота также могут быть разнообразны. Есть микроорганизмы, способные усваивать молекулярный азот атмосферы. Они называются азотфиксирующими. Другие — ассимилируют неорганический азот из солей аммония, нитратов или нитритов и, соответственно, называются, аммонифицирующими, нитрат- и нитрит-редуцирующими бактериями. Однако патогенные для человека микроорганизмы способны ассимилировать только азот органических соединений.

Механизмы питания бактерий.

Под питанием понимается процесс поступления в клетку питательных веществ и выделение продуктов метаболизма.

Особенности этого процесса:

— бактериальные клетки лишены специальных органов для захвата и переваривания пищи. Поступление питательных веществ у них происходит путем всасывания через всю поверхность.

— бактерии выделяют во внешнюю среду экзоферменты, с помощью которых они и расщепляют сложные вещества до простых.

Различают 2 механизма поступления питательных веществ в клетку:

— активный транспорт осуществляют особые белки-переносчики, он осуществляется при затрате энергии и идет против градиента концентрации;

— пассивный транспорт – это простая и облегченная диффузия.

Источник

Окраска спор у бактерий

Вводные пояснения. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной, если превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки эту клетку называют соответственно клостридиальной или плектридиальной.. В бациллярной клетке спора может размешаться в центре клетки — центральное положение, на конце — терминальное и ближе к одному из концов — субтерминальное положение.

При наблюдении за живыми спорообразующими бактериями их споры можно различить по более сильному преломлению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней свободной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными (негативная окраска).

В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочкой на первом этапе окраски спор применяют химические вещества, изменяющие структуру их оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Для того чтобы на препарате оставались прокрашенными только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, забирая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Этого достигнуть нетрудно, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем поглощенный цитоплазмой клетки.

Таким образом, все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.

Метод Циля—Нильсена в модификации Мюллера. Мюллер, модифицировав известный метод Циля—Нильсена, применяемый обычно для выявления кислотоустойчивости бактерий (дифференциальной окраски микобактерий и некоторых близких к ним микроорганизмов), снизанной с особенностями химического состава их оболочки, предложил использовать его для окраски спор бактерий.

До фиксации мажа бактерий на пламени препарат готовят обычным способом (см. 2.2.1). Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хромовой кислоты. Через 5—10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.

Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15—30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16—18 с (размеренно считая вслух от 21 до 37—40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.

Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15—20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма — в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий.

1. Карболовый фуксин Циля (см. 3.2.2).

2. Метиленовый синий Леффлера (см. 3.2.2).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

5. Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Источник

Окрашивание спор: обоснование, методы и использование

Содержание:

В окрашивание спор Это методика, используемая для окраски резистентных структур, образующих некоторые роды бактерий, когда они находятся в неблагоприятных условиях; Эти структуры соответствуют форме выживания.

Есть много родов, образующих споры; однако основными из них являются Bacillus и Clostridium. Эти роды считаются более актуальными, поскольку имеют патогенные для человека виды.

Каждая бацилла может дать начало споре. Во время окрашивания препарата споры могут быть обнаружены внутри палочки (эндоспора) или вне ее (экзоспора). При использовании обычных методов окрашивания бактерий, таких как окраска по Граму, споры остаются бесцветными.

В настоящее время существует несколько методик окрашивания, которые способны проникать в толстую структуру спор и окрашивать их. Эти методологии очень разнообразны; К ним относятся техника Дорнера, окраска Мёллера и методология Шеффера-Фултона, также известная как Виртц-Конклин.

Из всех упомянутых методов методология Шеффера-Фултона наиболее широко используется в рутинных лабораториях. Он назван в честь двух микробиологов, создавших окраску в 1930 году: Алисии Шеффер и Макдональда Фултона. Однако эту технику иногда называют Виртц-Конклин в честь двух бактериологов 1900-х годов.

Основа

Споры не окрашиваются обычными пятнами, потому что у них очень толстая стенка. Сложный состав спор предотвращает попадание большинства красителей.

Если спора исследуется снаружи внутрь, наблюдаются следующие слои: во-первых, это экзоспорий, который является самым тонким и внешним слоем, образованным гликопротеинами.

Далее идет кутикула, которая обеспечивает устойчивость к высоким температурам, за ней следует кора, состоящая из пептидогликана. Затем идет основная стена, защищающая протопласт.

Спора представляет собой обезвоженную структуру, содержащую 15% кальция и дипиколиновую кислоту. Поэтому большинство методов окрашивания спор основаны на приложении тепла, чтобы краситель мог проникнуть в толстую структуру.

Как только спора окрашивается, она не может удалить краситель. В методе Шеффера-Фултона малахитовый зеленый проникает в вегетативные клетки и при воздействии тепла проникает как в эндоспоры, так и в экзоспоры.

При промывании водой краситель удаляется из вегетативной клетки. Это происходит из-за того, что краситель малахитовый зеленый имеет слегка щелочную основу, поэтому он слабо связывается с вегетативными клетками.

Вместо этого она не может выйти из споры, и в конечном итоге бацилла окрашивается сафранином. Эта основа действительна для остальных техник, в которых происходит нечто подобное.

Методы окрашивания спор

Для окрашивания спор необходимо получить чистую культуру подозрительного штамма, который необходимо изучить.

Культуру подвергают воздействию экстремальных температур в течение 24 часов, чтобы стимулировать споруляцию микроорганизмов. Для этого культуру можно поместить в духовку при 44 ° C или в холодильник (8 ° C) на 24 или 48 часов.

Если оставить слишком долго при указанных температурах, будут наблюдаться только экзоспоры, поскольку все эндоспоры уже вышли из бациллы.

По истечении этого времени на чистое предметное стекло следует нанести несколько капель стерильного физиологического раствора. Затем берется небольшая порция культуры и делается мелкая намазка.

Затем его оставляют сушиться, нагревают и окрашивают одним из способов, описанных ниже:

Техника Дорнера

1- Приготовьте в пробирке концентрированную суспензию спорулированных микроорганизмов в дистиллированной воде и добавьте равный объем отфильтрованного фуксина киньюнкарбол.

2- Поместите трубку в ванну с кипящей водой на 5-10 минут.

3- На чистом предметном стекле смешайте каплю предыдущей суспензии с каплей 10% водного раствора нигрозина, прокипятите и профильтруйте.

4- Намажьте и быстро высушите на слабом огне.

5- Осмотрите с объективом 100X (погружение).

Споры окрашиваются в красный цвет, а бактериальные клетки кажутся почти бесцветными на темно-сером фоне.

Модифицированная техника Дорнера

1- Суспензию спорулированного микроорганизма наносят на предметное стекло и фиксируют в тепле.

2- Образец покрывают полосой фильтровальной бумаги, к которой добавлен карболовый фуксин. Краситель нагревают в течение 5-7 минут пламенем горелки Бунзена до образования паров. Затем бумага удаляется.

3- Препарат промывают водой, а затем сушат промокательной бумагой.

4- Покройте мазок тонкой пленкой 10% нигрозина, используя второе предметное стекло для распределения нигрозина или иглу.

Окраска, принимаемая спорами и бактериями, такая же, как описанная в предшествующем уровне техники.

Метод Шеффера — Фултона или Виртца-Конклина

1- Сделайте тонкий мазок суспензии спорообразующих микроорганизмов на предметном стекле и зафиксируйте на нагревании.

2- Покройте предметное стекло 5% водным раствором малахитового зеленого (вы можете поместить на предметное стекло фильтровальную бумагу).

3- Нагрейте пламя горелки Бунзена, чтобы вызвать выделение паров и погасить пламя. Повторяйте операцию в течение 6-10 минут. Если во время процедуры раствор малахитового зеленого испаряется слишком сильно, можно добавить еще.

4- Снимите фильтровальную бумагу (если она установлена) и промойте водой.

5- Покройте предметное стекло 0,5% водным сафранином на 30 секунд (в некоторых вариантах техники используется 0,1% водный сафранин и оставляют на 3 минуты).

При использовании этой техники споры становятся зелеными, а бациллы — красными.

Его недостатком является то, что эндоспоры молодых культур плохо окрашиваются, так как они выглядят чрезвычайно прозрачными или бесцветными. Чтобы этого избежать, рекомендуется использовать культуры 48-часовой инкубации.

Техника Мёллера

1- Покройте мазок хлороформом на 2 минуты.

2- Выбросьте хлороформ.

3- Покройте 5% хромовой кислотой на 5 минут.

4- Промыть дистиллированной водой.

5- Лист покрывают карбол фуксин-феникада и подвергают воздействию пламени горелки Бунзена до выделения паров; затем его снимают с пламени на несколько мгновений. Операция повторяется до истечения 10 минут.

6- Промыть водой.

7- Используйте подкисленный этанол (соляной спирт) для обесцвечивания. Его оставляют на 20 или 30 секунд.

8- Промыть дистиллированной водой.

9. Контрастируйте, покрыв лист метиленовым синим на 5 минут.

10- Промыть дистиллированной водой.

11- Дайте ему высохнуть и перенесите образец в микроскоп.

Споры кажутся красными, а бациллы — синими. Важно не вдыхать пары, так как они токсичны и в долгосрочной перспективе могут быть канцерогенными.

Модифицированная техника Мёллера без нагрева

В 2007 году Хаяма и его сотрудники создали модификацию техники Меллера. Они исключили этап нагревания красителя и заменили его добавлением 2 капель поверхностно-активного вещества Tergitol 7 на каждые 10 мл раствора карбол фуксин-карбол. Были получены такие же результаты.

Приложения

Окрашивание спор дает очень ценную и полезную информацию для идентификации патогена, поскольку его присутствие, форма, расположение внутри бациллы и способность деформировать вегетативную клетку или нет, являются данными, которые могут определять вид. вовлечены в определенный жанр.

В этом контексте стоит сказать, что споры могут быть круглыми или овальными, они могут располагаться в центре или также в парацентральном, субминальном или конечном положении.

Примеры

— Clostridium difficile образует овальную спору в конечном положении, которая деформирует палочку.

— СпораClostridiumтертий он овальной формы, не деформирует палочку и находится на терминальном уровне.

— Эндоспора Clostridium тетани он конечен и деформирует палочку, создавая вид голени.

— Споры Clostridium botulinum, С.гистолитикум, С.новинка Y C. septicum они имеют округлую или субтерминальную овальную форму и деформируют палочку.

— Эндоспора Clostridium sordelli он расположен в центральном положении, с небольшой деформацией.

Ссылки

1. Хаяма М., Оана К., Козакаи Т., Умеда С., Фудзимото Дж., Ота Х., Каваками Ю. Предложение упрощенной техники окрашивания спор бактерий без применения тепла — успешная модификация метода Меллера. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Авторы Википедии. Пятно Меллера. Википедия, свободная энциклопедия. 3 ноября 2018 г., 03:28 UTC. Доступно на: en.wikipedia.org
3. Перес Р., Хуарес М., Родригес (2011). Руководство лаборатории микробиологических методов. Отделение фундаментальных наук Академии микробиологии. Национальный политехнический институт.
4. «Эндоспора».Википедия, свободная энциклопедия. 25 февраля 2018 г., 10:20 UTC. 10 янв 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Сильва Л., Сильва С., Фернандес Н., Буэно С., Торрес Дж., Рико М., Масиас Дж. И соавторы. (2006). Трудовые кадры автономного сообщества Эстремадура. Конкретная повестка дня Том IV. Редакция MAD. Севилья-Испания, стр. 211-212.
6. Сильва М., Гарсия М., Корралес Дж., Понсе Э. (2006). Техник-лаборант Галицкой службы здравоохранения (СЕРГАС). Конкретная тематика повестки дня. Том 2. От редакции МАД. Севилья-Испания, стр 79-80.
7. Конеман Э, Аллен С., Джанда В., Шрекенбергер П., Винн В. (2004). Микробиологическая диагностика. (5-е изд.). Аргентина, редакция Panamericana S.A.
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологическая диагностика Бейли и Скотта. 12 изд. Аргентина. Редакция Panamericana S.A

Антрацен: структура, свойства, токсичность и применение

Германий: история, свойства, строение, получение, применение

Источник