Укажите наиболее рациональные способы индикации микробов

Индикация бактериальных средств

Одной из самых сложных и необходимых мер борьбы с ин­фекционными болезнями, особенно при бактериологическом на­падении, является индикация патогенных микробов. От того, как быстро обнаружен возбудитель (возбудители), чем раньше они типированы, тем полнее возможности дальнейших меропри­ятий.

Специфическая индикация – это комплекс мероприятий, про­водимых для быстрого обнаружения патогенных бактерий, гриб­ков, риккетсий, вирусов, бактериальных токсинов и определения их видовой принадлежности. Индикация – относительно мало раз­работанная глава микробиологии. Лишь в последние годы она стала обогащаться более современными методами исследований.

Индикация проводится с учетом возможного наличия в иссле­дуемом материале различных и в первую очередь патогенных микробов и их токсинов. Индикацию следует начинать с прие­мов, в первую очередь выявляющих возбудителей особо опасных инфекций.

В условиях бактериологической войны наиболее вероятным способом распространения микробов, вирусов и пр. станет аэро­зольный способ. Он может быть использован не только для рас­пространения так называемых «аэрогенных» (дифтерия, чума и пр.), но и для микробов других групп, особенно риккетсиозов.

В связи с этим исследования необходимо проводить на на­личие всех микроорганизмов, которые возможно могут быть применены при биологическом нападении.

При индикации важно строго выполнять правила забора проб и срочной доставки их в лабораторию. Не менее важна чувствительность того или иного метода. К сожалению, совре­менные методы бактериологических исследований в ряде слу­чаев мало чувствительны и не всегда позволяют обнаружить в пробе единичные микробные клетки.

При индикации патогенных микробов бактериолог может встретить измененные формы микроорганизмов. Они могут воз­никнуть не преднамеренно, а в силу воздействия факторов внеш­ней среды. Так, у чумных микробов, распыленных в воздухе, наблюдается понижение потребности в кислороде и ослабленная вирулентность для морских свинок.

Большое значение приобретает изменчивость микробов. До­казано, что под действием ряда мутагенных факторов могут воз­никать штаммы, не растущие на обычных питательных средах, изменяющие не только свою антигенную структуру, но и отно­шение к антибиотикам, питательным средам, дезинфицирующим веществам и пр. Необходимо разработать специальные, пригод­ные для обнаружения таких штаммов методы.

Основное направление бактериологических исследований при индикации — получение чистой культуры с последующей ее идентификацией всеми современными методами.

Различают специфическую и неспецифическую индикацию.

Неспецифическая индикация

Методы неспецифической индикации являются общими для бактерий и вирусов и сводятся к визуальному наблюдению за районом предполагаемого заражения, а также к определению увеличенной концентрации аэрозольных частиц и животного белка в воздухе, сравнительно с предыдущим периодом или со средними данными обычной концентрации. Это определение осу­щест­вля­ется с помощью приборов, работающих на физико-хими­ческих принципах.

Как было указано выше, наиболее вероятным способом рас­пространения патогенных микробов является аэрогенный. По­явление аэрозольного облака за летящим самолетом — простей­ший визуальный сигнал бактериологического нападения. Метод визуального наблюдения отличается простотой и, несмотря на субъективность результатов, позволяет обнаруживать подозри­тельные частицы пыли, порошкообразные вещества, капли жид­кости, переносчиков и грызунов и, при опре­де­ленных условиях, даже аэрозольный туман.

Наиболее эффективным способом рассеивания микроорганиз­мов служит аэрозоль, поэтому особенную ценность представля­ют устройства для автоматического улавливания в воздухе белка и анализа частиц аэрозоля. К таким устройствам относятся струнные фотоэлектриче­ские счетчики. Принцип конструкции струнных счетчиков со­стоит в том, что в этом приборе возникают электрические им­пульсы при ударе мельчайших частиц о медную нить. Импульсы в дальнейшем усиливаются и передаются в счетчик, способный учесть до 2000 частиц в секунду. Фотоэлектрический счетчик учитывает взвешенные в воздухе частицы. Усеянный аэрозолями свет учитывается фотоэлемен­том, который посылает на усилитель, последний автоматически определяет интенсивность заражения (до 1000 частиц в 1 мл воздуха).

Названные типы приборов постоянно совершенствуются. На­ряду с автоматическими сигнализаторами для улавливания и учета частиц аэрозоля создаются различные модели импакторов, аэрозолескопов, электростатических и фотоэлектронных счетчиков и других анализирующих устройств.

Наиболее современными являются каскадные импакторы, в которых происходит принудительная седиментация частиц аэрозоля на стеклянные пластинки с последующим их анализом с помощью светового микроскопа. Термопреципитаторы обеспе­чивают осаждение частиц на движущуюся бумажную или пласт­массовую ленту. Электростатические счетчики учитывают элек­трические импульсы, возникающие при ударе частиц о медную нить, аэрозолескопы подсчитывают частицы аэрозоля, опреде­ляют их размеры; фотоэлектронные счетчики основаны на улав­лива­нии фотоэлементом лучей света, рассеянных частицами аэро­золя, и трансформации их в электрические импульсы, улавли­ваемые счетчиком.

Устройства, предложенные для исследования воздуха на бе­лок, работают на принципах той или иной химической реакции (биуретовая, пиролиза и др.).

Биуретовая проба. К суспензии микробов прибавля­ют гидроокись натрия и сульфат меди, и с помощью фотоэлек­трического абсорбциометра определяют интенсивность пурпур­ной окраски, которая пропорциональна количеству микроорга­низмов. Этот метод прост, но не чувствителен.

Более эффективная реакция пиролиза — разложение белка под действием высокой температуры. При 315—482° мик­робные клетки разлагаются и образуют синильную кислоту, определя­е­мую специальным индикатором. Однако этим методом нельзя определить происхождение белка.

Необходимость методов неспецифической индикации несом­ненна. Однако эффективность существующих приборов неодина­кова и часто недостаточна. Необходимы упрощения их конст­рукции и использования мощных воздухозаборников. Наиболее перспективными из них являются автоматические сигнализаторы, сочетающие принципы улавливания белка и подсчет частиц аэрозоля с одновременной сигнализацией и распылением в воз­духе бактерицидных веществ.

Источник

Глава 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель идентификации микроорганизмов – определение принад­лежности отдельных их популяций к тем или иным видам, родам, семействам и т.д. Процесс идентификации микроорганизмов явля­ется одним из самых важных и трудоемких этапов проведения био­логических исследований.

Методы идентификации различных микроорганизмов разраба­тывались и совер­шенство­вались микробиологами и бактериоло­гами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно ис­пользуются в науке, медицине, фармацевтике, промышленном производстве (в том числе продуктов питания).

Разработанные ранее методы представляют собой основу для ис­следователей и являются базисом большого количества методик, которые позволяют определять следующие свойства бактерий;

• морфологические (особенности и индивидуальные свойства строения клеток);
• культуральные (питание, дыхание, условия роста бактериальной культуры);
• ферментативные (биохимические свойства, связанные со спо­собностью бактериаль­ной культуры расщеплять сахара, белки, разрушать эритроциты);
• антигенные (свойства, связанные с особенностями антигенов чистой бактериальной культуры).

Идентификация любых бактерий с использованием метода по­сева на питательные среды невозможна без выделения чистой куль­туры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присут­ствие микробов других родов и семейств во время проведения бак­териологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь делает неверные заклю­чения.

Проблема получения чистой культуры и объективной иденти­фикации микроорга­низмов всегда актуальна для микробиологии, микологии и вирусологии. Разработанные методы идентификации микроорганизмов делят на рутинные и современные. Предпочте­ние отдается методам идентификации, которые выполняются за отно­сительно короткий срок (часы) и отличаются высокой степенью объективности и точности.

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в ре­зультате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, осно­ванное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе позволяет по­строить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.

Рутинные методы основаны на получении чистой культуры и изучении ее разно­образных свойств: морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и биоло­гических. При этом затрачивается не только множество компонентов реакций и пита­тельных сред, но и, что очень важно при санитарно-микробиологи­ческой оценке пищевых продуктов, времени.

При идентификации микроорганизмов, например дрожжей, ис­пользуют метод нумерической таксономии. Он основан на сле­дующей идее: считаются равноценными различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных признаков. Путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее 100) фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс», определяется сходство между двумя исследуемыми организмами. Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства.

Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Ко­эффициент 1 означает полную идентичность, а 0 – полное несход­ство. Оценки комбинаций признаков произво­дят с помощью ком­пьютера. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и/или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микро­организмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не по­зволяет делать непосредственные выводы относительно генетиче­ского родства микроорганизмов, однако в известной степени отра­жает их филогенетические свойства. Так, установлено, что фенотипические признаки бактерий, поддающиеся изучению в на­стоящее время, отражают от 5 до 20% свойств их генотипа.

Современные методы идентификации не требуют многочислен­ного квалифи­циро­ванного персонала и большого количества вре­мени. Некоторые из них не требуют получения чистых культур. Они в свою очередь делятся на ручные и автоматические.

5.1. РУЧНЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

К ручным методам идентификации микроорганизмов относят: систему индикаторных бумажек, наборы мультимикротестов, метод хроматографии.

Ручные тесты, применяемые для индикации и идентификации микроорганизмов, важны для медицинской микробиологии и ши­роко используются в санитарной микробиологии. Их постановка требует соблюдения стандартных условий проведения.

В последние десятилетия разработаны различные тест-системы: API-20E, Enterotube, Mycotube, Patho-Tec, СИБ, ПБДЭ и др. Система Enterotube представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды. Засев всех сред производится поступательно-вращательными движениями через ка­меру петли с посевным материалом. Инкубацию проводят в течение 24 ч при 37°С. О поло­жительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообра­зование) или после введения специальных реактивов (тест на обра­зование индола, реакция Вогес–Проскауэра). Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и полу­чить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

Система индикаторных бумажек (СИБ). Она представляет собой диски, пропи­танные различными питательными средами. Эти спе­циальные диски можно вносить в пробирки с бактериями или предварительно вкладывать в лунки планшетов, в которые вносят исследуемые культуры микроорганизмов. В частности, используют наборы дисков фирм Minitek (Enterobacteriaceae) и Minitek (Neisseria) для идентификации энтеро­бак­терий и нейссерий. Способ позволяет получить результаты через 4 ч инкубации при 37°С.

Наборы мультимикротестов. Они представляют собой планшеты из пластика с лунками. В лунках располагаются питательные суб­страты с индикаторами продуктов метаболизма бактерий. В лунки помещают суспензии изучаемых бактерий и термо­статируют. Для идентификации гемофилов, энтеробактерий, листерий, стафило­кокков и др. используют тесты RapID NH, которые позволяют по­лучить ответ не позднее 4–8 ч.

Серологические методы идентификации бактерий. С их помощью, используя специфические антитела, выявляют бактериальные антигены. Чаще всего в настоящее время пользуются методами ИФА-твердофазным и латекс-агглютинации.

Иммуномагнитное разделение. В основу метода положено ис­пользование активиро­ванных парамагнитных частиц размером порядка 2–3 мкм, которые покрываются анти­телами путем выдержи­вания при пониженной температуре до 24 ч. После инкубации несвязавшиеся антитела отмывают. После такой обработки частицы, покрытые анти­телами, добавляют к суспендированной пробе про­дукта питания, предположительно со­дер­жащей антигены, к ко­торым специфичны антитела частиц (токсины или целые клетки в случае грамотрицательных бактерий). После добавления частиц пробу инкуби­руют при нормальной температуре от нескольких минут до нескольких часов, чтобы антитела связались с антигеном. Образованные комплексы собирают магнитом, после чего элюируют антиген и подсчитывают количество связавшихся частиц. Элюированный и сконцентрированный антиген может быть под­вергнут другим методам анализа. Так, в одном из исследований им­муномагнитное разделение было сопряжено с проточной цитометрией для установления присутствия в пробе одного из штаммов Е. coli. После отмывки от парамагнитных частиц клетки были по­мечены флуоресцентными антителами, что позволило подсчитать их количество с помощью проточной цитометрии. Этот метод обла­дает чувствительностью и позволяет обнаружить примерно 10 КОЕ в пробе говяжьего фарша.

Хроматографические методы. С целью индикации и идентифи­кации микроорга­низмов нередко используют хроматографические методы. В объектах исследования определяют химический состав клеточной стенки и некоторые метаболиты микро­организмов, причем как промежуточные, так и уникальные. Чаще всего у бак­терий определяют короткоцепочечные жирные и тейхоевые кис­лоты, миколевую кислоту, используя метод газожидкостной хрома­тографии.

Нередко пользуются тонкослойной хроматографией. Содер­жание этих веществ у различных родов бактерий постоянное, и это явление позволяет идентифицировать виды.

Различия в составе липидов используют для идентификации бактерий на уровне рода и даже вида. Однако этот метод имеет определенные ограничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может зависеть от условий культивирования и возраста культуры.

В систематике некоторых бактерий учитывается состав хинонов и других пере­носчиков электронов, а также пигментов.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, сум­марных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление – белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и ис­пользуются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характеристики химических соеди­нений клетки не могут использоваться для иден­тификации бактерий изолированно от других данных, описы­вающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фе-нотипических признаков.

5.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли широкое применение в основном при диагностике инфекций. В настоящее время используются тест-системы для распознавания таких видов и групп бактерий, как хламидии, микобактерии, энтерококки, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококки группы В.

Метод сравнения геномов по составу основания ДНК. Как из­вестно, ДНК содержит четыре азотистых основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц). По правилам спаривания осно­ваний А = Т и Г = Ц, но молярное отношение (Г + Ц) : (А + Т) ва­рьирует у разных видов и может служить таксономической характе­ристикой.

Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т.е. по температуре, при которой происходит разрыв водородных связей, соединяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плот­ности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (мак­симум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК погло­щение возрастает, а когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.

Каждый бактериальный вид ДНК содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравни­ваемых микроорганизмов существенно отличается (10–15%), то говорят об их принадлежности к различным таксономическим группам. Однако отсутствия существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заключения о тож­дестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие генетические ме­тоды.

Гибридизация нуклеиновых кислот. В основу метода положена способность нуклеиновых кислот соединяться с комплементар­ными фрагментами искусственных нитей ДНК/РНК, названная гибридизацией. Искусственные нити метят изотопами или фермен­тами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Затем образец ис­следуют в ИФА.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот на твердой основе и его сэндвич-модификация распространены больше. В качестве твердой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или ней­лона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыва­нием.

Метод генных зондов. Его используют для идентификации бак­терий. От обычной ДНК–ДНК гибридизации этот способ отлича­ется использованием не тотальной ДНК, а ее определенного фраг­мента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фраг­менты ДНК разделяют электрофоретически, методом трансфор­мации определяют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным из­вестным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, а затем гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауторадиографии выявляют относи­тельную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бак­терии – донора ДНК) и исследуемой бактерий.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сущностью реакции явля­ется амплификация, т.е. увеличение числа копий строго опреде­ленных фрагментов молекул ДНК in vitro. Амплифицируемый участок именуют амплификоном.

Для работы ДНК-полимеразы необходимым условием является наличие матрицы и затравки (праймеров). Матрицей является одноцепочечная ДНК, которую ДНК-полимеразы копируют, синте­зируя комплементарную полидезоксирибонуклеотидную цепь. Синтез не может начаться без затравки (праймера), представ­ляющей собой олиго- или полинуклеотид, комплементарный матрице и имеющий свободную 3 -1 -ОН группу, с которой начина­ется присоединение первого нуклеотида вновь синтезируемой цепи. После присоединения каждого нового звена удлиненная цепь содержит на 3 -1 -конце свободную гидроксильную группу, к ко­торой может присоединяться новое звено нуклеотидов. Процесс продолжается пока ДНК не станет полностью двухцепочечной. Таким образом, фермент выполняет функцию отбора нуклеозид-трифосфатов, комплементарных каждому следующему звену ма­трицы.

Праймеры – это отрезки одноцепочечной ДНК длиной 20–30 нуклеотидов, компле­ментарные каждой цепи матрицы и слу­жащие затравкой для синтеза новой цепи ДНК. Праймеры компле­ментарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничи­вающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3 -1 -концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать.

При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК, и каждая из вновь синтезиро­ванных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может слу­жить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера.

Продолжительность реакции определяется числом циклов, не­обходимых для синтеза ДНК-амплификаторов в количестве, доста­точном для дальнейшего исследования или последующей инди­кации.

Индикация может быть произведена известными способами: электрофорезом в агарозе с окрашиванием бромистым этидием, ги­бридизацией с изотопно или неизотопно мечеными генными зон­дами, непосредственным колориметрическим, флуорометриче-ским, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот.

Основные компоненты ПЦР:

• термостабильный фермент ДНК-полимера;
• пара олигонуклеотидных праймеров;
• четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов;
• копируемая ДНК;
• ионы Мg +2 , необходимые для функционирования ДНК-поли-меразы;
• буферный раствор для поддержания рН во время ПЦР между 6,8–7,8 и минеральное масло для предотвращения испарения.

Используется также аплификатор – прибор для проведения ре­акции в автоматическом режиме, обеспечивающий поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.

Технология идентификации ДНК-содержащих микроорга­низмов выглядит следующим образом.

1. Из исследуемого материала выделяется ДНК-матрица.
2. В пробирке смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу.
3. Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК –94°С (при этом две цепи ДНК расходятся).
4. Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров, в после­дующем с ДНК-матрицей (40–60°С).
5. ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраи­вание нитей ДНК с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (72°С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала.
6. В последующем цикле синтез осуществляется с четырех копий, далее с восьми и т.д. до 20–30 циклов. В результате полу­чают миллионы копий специфического участка ДНК вируса или бактерии.
7. Проводится индикация амплифицированного генетического материала вышеизло­женным способом.

В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит ма­трицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и по­следовательности участку ДНК, выбран­ному для амплификации.

Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФ-излучение (для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов).

Индикация РНК-содержащих вирусов включает следующие этапы.

1. Выделение РНК из вируссодержащего материала.
2. Синтез на молекуле РНК вируса комплементарной ей цепи ДНК с помощью специфических праймеров и ревертазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы).
3. Амплификация комплиментарной ДНК методом ПЦР.
4. Многократное повторение циклов денатурации к ДНК в ис­следуемой пробе при температуре 94°С.
5. Сплавление (ожиг) при температуре 56°С с исследуемой ДНК специфичных нуклеотидных затравок (праймеров) и синтез в них при температуре 72°С комплементарных цепей ДНК с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Это приводит к тому, что после 30–40 циклов амплификации концентрация синтезиро­ванного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет легко учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием на приборе «Трансиллюминатор».

Анализ с помощью микроматриц. Простейшая микроматрица яв­ляется твердым носителем (нейлоновая мембрана, стеклянный слайд или кремниевая пластинка), на который нанесены небольшие количества одноцепочечной ДНК (оцДНК) различных известных видов бактерий. Когда на микроматрицу наносится оцДНК, если на матрице имеются комплементарные ей цепи, происходит гибри­дизация. Анализ при помощи метода ДНК-микроматрицы для ми­кроорганизмов проходит через этапы подготовки зондов, гибриди­зации и анализа результатов.

На настоящий момент на одной микроматрице помещается от нескольких сотен до нескольких тысяч проб оцДНК различных видов микроорганизмов. При исследовании патовариантов Xanthomonas использовали микроматрицу с 47 пробами для фингер-принтинга 14 близкородственных штаммов. Этим методом были выявлены однозначные различия между штаммами.

Для определения количественного и видового состава бактери­ального сообщества без культуральной изоляции можно использо­вать пробы из последовательности 16S-РНК. Очевидно, что метод микроматриц представляет собой отличный инструмент для опре­деления видов бактерий и биотипирования. Микроматрицы произ­водятся множеством коммерческих предприятий. Среди произво­димых микроматриц существуют ДНК-, РНК- и белковые микро­матрицы, причем последние находят широкое применение.

5.3. АВТОМАТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

Системы распознавания с использованием специальных при­боров позволяют за сравнительно короткое время определить вид микроорганизма, а также его чувствительность/устойчивость к ан­тимикробным препаратам.

Наибольшей популярностью пользуются автоматические системы идентификации микроорганизмов типа Microscan и Vitek.

Система Microscan. Данная система идентификации бактерий основана на явлениях турбидиметрии, колориметрии и флуоресценсии. Система включает ряд пластиковых планшетов, в которые помещены биохимически активные субстраты. В основу распо­знавания грамотрицательных бактерий положено свойство комплекса антиген + антитело испускать «холодное» свечение благодаря ис­кусственной адсорбции на антителах, светящихся в УФ-лучах, спе­циальных белков – флуорохромов. Время анализа – 2 ч. Гемо-филы, анаэробы и дрожжи идентифицируются методом, осно­ванным на иммуно­хроматографии. Концентрацию антибиотиков определяют с учетом оптической плотности исследуемого суб­страта. Система оборудована компьютером и программным обеспе­чением.

Система Vitek. Здесь используют планшеты. Суспензию бак­терий определенной концентрации вносят в лунки. Распознавание микроорганизмов основано на турби­дометрии раствора в лунке. Время анализа — от 4–8 до 18 ч. Система оборудована компью­тером и программным обеспечением.

Биосенсоры – оптоволоконные методы. Оптическим волокном называют волновод, выполненный из стекла или полимеров и про­водящий свет за счет полного внутреннего отражения. В оптоволо­конном биосенсоре для улавливания биологической реакции и пре­образования ее в различимый оптический сигнал используют опти­ческий или электронный преобразователь.

Оптоволоконный биосенсор представляет собой клиновидный оптоволоконный зонд, покрытый изнутри специфическими анти­телами. Свет полупроводникового лазера проходит через всю систему оптических волокон и выходит на ее конце в виде исче­зающей волны. Когда с антителами на конце связывается флуорес­центно меченый антиген, исчезающая волна взаимодействует с ним, испуская флуоресцентный сигнал во всех направлениях, в том числе и внутрь световода – к сенсорной системе. В качестве флуоресцентной метки используют флуоресцентные красители, такие как Су5.

В оптоволоконной системе поверхностного плазменного резо­нанса антитела закреплены на поверхности тонкой металлической пленки, расположенной на отражающей поверхности оптически прозрачного стеклянного световода. Когда сквозь волновод про­ходит видимый или инфракрасный свет, он отражается от металли­ческой пленки. Взаимодействие отраженного света с электронами на поверхности металла и резонансный эффект вызывают сильное поглощение, причем оно тем сильнее, чем выше концентрация комплексов антиген–антитело на поверхности металлической пленки. Чем больше комплексов образовалось, тем длиннее погло­щаемые волны.

Оптоволоконный биосенсор применяли для установления на­личия Е. coli 0157:Н7 в говяжьем фарше. При использовании двух световодов была достигнута пороговая чувствительность 9 × 10 и 5,2 × 10 КОЕ/г. Результаты были получены в течение 25 мин с мо­мента подготовки образца. При анализе использовали два типа ан­тител и флуоресцентный краситель Су5. Эта же система использо­валась для определения L. monocytogenes; инокулят имел концен­трацию менее 10 КОЕ/мл и подвергался 20-часовому обогащению. Результаты с биосенсора были получены за 20–45 мин.

Оптоволоконный биосенсор использовали для определения ста­филококкового энтеротоксина В в мясе и молоке. Результаты полу­чали в течение 5 мин при исполь­зовании одного антитела и в те­чение 8 мин – при использовании двух. Пороговая чувствитель­ность составила 10 нг/мл.

Метод микрокалориметрии. Метод основан на измерении эн­тальпии, которая изменяется вследствие метаболической актив­ности растущих микроорганизмов, так как производство тепла тесно связано с физиологической активностью клетки. Исследо­вания проводятся в дискретных или проточных микрокалориме­трах.

Изменения температуры, измеряемые с помощью биологи­ческих установок, происходят в результате катаболической актив­ности клеток. Чаще всего в пищевой микробиологии применяют установку, обладающую чувствительностью 0,01 кал/ч при объеме пробы 10 мл. Результаты микрокалориметрии зависят от вида микроорганизма, размера инокулята, субстратов и других пара­метров. Ученые при помощи этого метода успешно идентифициро­вали промышленные штаммы дрожжей. Для этой цели успешно применяется проточная микрокалориметрия.

В процессе измерений микрокалориметр находится в проточном калориметрическом сосуде. С использованием специальной среды, содержащей семь сахаров, были построены термограммы для де­вяти молочнокислых бактерий (родов Enterococcus, Leuconostoc и Lactobacillus), которые различаются между собой в степени, до­статочной для того, чтобы рекомендовать этот метод для их иден­тификации. Все культуры выращивались при 37°С (кроме культуры S. Cremoris, выращивавшейся при температуре 30°С), результаты были получены в течение 24 ч.

Метод использовали при определении бактериального зара­жения консервированных продуктов для разделения видов рода Enterobacteriaceae, определения наличия S. aureus и бактериального заражения говяжьего фарша. При установлении присутствия S. aureus результаты для начальной концентрации 1–10 клеток на 1 мл были получены за 2 ч. При начальной концентрации 2 клетки/мл для получения результатов потребовалось 12–13 ч.

Проточная калориметрия использовалась для определения жиз­неспособности восстановленных замороженных клеток S. cerevisiae в течение 3 ч после оттаивания.

При использовании метода для анализа мясного фарша пик производства тепла фиксируется через 24 ч после начала измерения при концентрации бактерий 1–10 КОЕ/г. Результаты микрокало­риметрии хорошо коррелируют с результатами прямого подсчета колоний. При концентрации организмов 10 КОЕ/г измеримая ско­рость производства тепла получается через 6 ч и достигает пика через 10 ч после начала измерения.

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите условия идентификации микроорганизмов, ее цель и свойства микробной культуры, которые определяют при идентифи­кации.
2. Кратко охарактеризуйте рутинные и современные методы идентифи­кации.
3. В чем сущность метода нумерической таксономии?
4. Опишите сущность систем Enterotube и индикаторных бумажек (СИБ), наборов мульти­микротестов.
5. Опишите сущность серологических методов идентификации бак­терий, метода иммуно­магнитного разделения, хроматографического метода.
6. Дайте краткое описание метода сравнения геномов по составу осно­вания ДНК.
7. Изложите сущность метода гибридизации нуклеиновых кислот и ме­тода генных зондов.
8. Подробно охарактеризуйте методику полимеразной цепной реакции (ПЦР).
9. Приведите автоматические системы идентификации бактерий: системы Microscan, Vitek, биосенсоры – оптоволоконные методы, метод микрокалориметрии.

Источник