Удаление кислорода механическим путем суть способа культивирования
Патогенные анаэробы — Ф. К. Черкес
Патогенные анаэробы относятся к семейству Bacillaceae, роду Clostridium. Анаэробы — обширная группа микроорганизмов, среди которых патогенны для человека: 1) клостридии столбняка; 2) клостридии газовой гангрены (полимикробная инфекция); 3) клостридии ботулизма.
Патогенные анаэробы являются постоянными обитателями кишечника животных и человека, с испражнениями которых выделяются во внешнюю среду. В виде спор они длительно сохраняются в почве, морской и пресной воде.
Патогенные клостридии — крупные палочки размером 4-9 × 0,6-1,2 мк, Молодые культуры грамположительны, старые теряют способность окрашиваться по Граму. Все клостридии образуют споры овальной или круглой формы, располагающиеся терминально, субтерминально или центрально. Большинство анаэробов подвижны. Жгутики располагаются перитрихиально. Клостридии продуцируют экзотоксины высокой биологической активности.
Культивируют анаэробы в безкислородных условиях. Существует несколько способов удаления кислорода при их культивировании: физические и биологические.
Физические методы. Удаление кислорода механическим путем. Удаление воздуха осуществляется в анаэростате — герметически закрывающемся приборе с устройством для откачивания воздуха. Портативный (переносной) анаэростат — небольшой цилиндр с герметически закрывающейся крышкой и краном для откачивания воздуха. Посевы устанавливают в анаэростат, создают вакуум в аппарате и ставят в термостат. Этот аппарат может быть заменен эксикатором.
Культивирование в атмосфере инертного газа. Воздух в анаэростате замещается азотом, смесью азота с углекислым газом или водородом.
Культивирование в высоком столбике агара с глюкозой. Микроорганизмы растут на дне, защищенные от воздуха высоким слоем среды.
Метод Виньяля — Вейона. Посев производят в пробирку с расплавленным и остуженным до 45° С агаром. Содержимое пробирки перемешивают и насасывают в пастеровскую пипетку, заполняя ее до верха. Надо следить, чтобы в пипетку не попали пузырьки воздуха. Тонкий конец пипетки запаивают, опускают в пробирку с ватой на дне и переносят в термостат. В толще агара вырастают изолированные колонии. Распилив капилляр пипетки, их извлекают.
Биологические методы. Совместное выращивание анаэробов и аэробов. В чашку Петри наливают толстым слоем агар с 5% крови. По диаметру чашки делают в агаре желобок, чтобы культуры не смешивались. На одну половину засевают культуру аэроба, на другую — анаэроба. Края чашки заливают парафином. Посевы помещают в термостат. Сначала вырастают аэробы, после того как они поглощают весь кислород, находящийся в чашке, начинают расти анаэробы.
Добавление в среду редуцирующих (окисляющих) веществ. Используют среду Китта — Тароцци, содержащую в качестве редуцирующих веществ 0,5% раствор глюкозы и кусочки мяса. Перед посевом среду кипятят 20 мин на водяной бане — удаляют растворенный в ней кислород. Быстро остужают до 45° С и засевают, не дав среде вновь насытиться кислородом. Сразу после посева в пробирку на поверхность среды наливают стерильное масло слоем 1-1,5 см, чтобы защитить посев от воздуха. Посевы выращивают в термостате.
Среда Китта — Тароцци. Бычью печень или мясо нарезают мелкими кусочками, заливают троекратным количеством питательного бульона рН 7,4-7,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют. Печень промывают на сите водой, распределяют в пробирки по 3-4 кусочка в каждую, заливают 7-8 мл бульона. Стерилизуют под давлением 1 атм 30 мин.
Кровяной агар. 3% МТТА с 1-2% глюкозы рН 7,2-7,4 смешивают с 15-20% свежей дефибринированной крови барана или лошади. Разливают в чашки Петри. Подсушивают в термостате 20-30 мин. Можно пользоваться кровью кролика или морской свинки, взятой из сердца стерильно, в количестве 5-1% среды.
Среда Вильсона — Блера. 100 мл 3% МПА с 1% глюкозы расплавляют на водяной бане, добавляют 10 мл 20% натрия сульфита и 1 мл 8% раствора железа хлорида. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят. Приготовленную среду разливают в пробирки по 7-8 мл.
Среда Виллиса — Хоббса. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы, 1,8 мл 1% раствора нейтрального красного. Автоклавируют, охлаждают до 50-55° С, добавляют 15 мл суспензии куриного желтка с изотоническим раствором натрия хлорида и 60 мл стерильного обезжиренного молока.
Существуют элективные среды для отдельных видов, типов бацилл и среды для лучшего токсинообразования.
В настоящее время широко применяются казеиново-дрожжевые, казенново-грибные, рыбокукурузные и другие среды.
Вегетативные формы анаэробов мало устойчивы. Споры очень устойчивы к физическим и химическим факторам: они переносят кипячение от 15-20 мин до нескольких часов в зависимости от вида, типа и штамма бацилл. Устойчивы также к низким температурам и высушиванию.
Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их только после длительной экспозиции (12-14 ч). Особенно устойчивы споры возбудителей ботулизма.
Токсины анаэробов, как и большинство экзотоксинов, чувствительны к высоким температурам, действию прямых солнечных лучей и дезинфицирующих веществ. Экзотоксин С. botulinum обладает высокой устойчивостью — разрушается только при 15-20-минутном кипячении.
Контрольные вопросы
1. Каковы условия культивирования анаэробов?
2. В чем основное отличие условий культивирования аэробов от анаэробов?
3. Что такое анаэростат?
4. Какие существуют методы культивирования анаэробов?
5. Благодаря чему создаются анаэробные условия для культивирования на среде Китта — Тароцци?
Источник
Удаление кислорода механическим путем суть способа культивирования
Для успешного культивирования микроорганизмов важно не только правильно подобрать питательную среду и правильно произвести посев, но еще необходимо создать и оптимальные условия: обеспечить соответствующую температуру, влажность, аэрацию. Как правило, успешное культивирование микроорганизмов в лаборатории удается только при тщательном воспроизведении условий природной для них среды.
Оптимальную температуру при культивировании большинства патогенных для теплокровных (в том числе и человека) микроорганизмов (37 градусов) создают в термостате.
Термостат представляет собой прибор с двойными стенками, между которыми находится воздух или вода. Подогрев воды осуществляется при помощи электрического тока. Термостат снабжен терморегулятором, автоматически поддерживающим нужную температуру, и термометром для контроля за температурой.
Пробирки с посевами устанавливают в штативах на полках термостата. Чашки в термостате должны стоять вверх дном.
Чтобы воздух в термостате свободно циркулировал и нагрев был равномерным, полки в термостате делают с прорезами и при работе плотно не загружают.
Чтобы не охладить культуры, термостат надолго не оставляют открытым.
Жизнь микроорганизмов возможна только во влажных условиях. Для микробов необходима капельно – жидкая среда – вода, так как питательные вещества проникают в клетку только в растворенном состоянии. Минимальное содержание свободной воды, при котором еще возможно развитие, для большинства микроорганизмов равно примерно 20%.
При культивировании в жидких питательных средах проблемы поддержания влажности не существует.
Свежеприготовленные агаризированные среды всегда содержат некоторое количество капельно – жидкой воды. Она бывает заметна в виде более или менее обильного конденсата, Однако при длительном хранении культур на плотных средах при комнатной температуре и даже в холодильнике среды подсыхают, что может привести к гибели микроорганизмов. Поэтому необходимо производить регулярные своевременные пересевы культур, не допуская подсыхания сред. Если предполагается длительное культивирование в термостате, то чашки или пробирки лучше всего поместить во влажную камеру, т.е в закрытый сосуд, где имеется емкость с водой. Некоторые грибы могут расти на плотных субстратах без капельно – жидкой среды, но во влажной атмосфере.
В день посева плотные питательные среды, основу которых составляет агар – агар, расплавляют на водяной бане и в жидком состоянии стерильно разливают в чашки Петри. После застывания агара и подсушивания конденсационной воды в термостате, можно производить посев на пластинчатый агар. Скашивать плотные питательные среды в пробирках также лучше в день посева. При культивировании микробов особенно чувствительных к отсутствию влаги (например, гонококков) в термостат ставят открытый сосуд с водой.
Подавляющему большинству микробов, в том числе и патогенным, свет не нужен. Прямые солнечные лучи отрицательно влияют на развитие многих микроорганизмов, поэтому их культивируют в неосвещенных термостатах. Однако, для изучения пигментообразования, которое происходит активнее при рассеянном свете, культуры после термостата выдерживают 2 – 3 дня при комнатном освещении.
Микроорганизмы, использующие в процессах обмена веществ энергию света, выращиваются при освещении. Для освещения обычно применяют лампы накаливания мощностью 75 – 100 вт. При культивировании водорослей можно использовать и люминесцентные лампы.
Большинство патогенных микробов культивируют 18 – 24 часа, но есть виды, развивающиеся значительно быстрее (холерный вибрион 8 – 10 часов) или медленнее (бруцеллы 5 – 27 дней, туберкулезные бактерии 4 – 6 недель и т.д.).
Продолжительность культивирования микроорганизмов зависит от скорости их размножения. Чтобы сохранить влагу в пробирках при длительном культивировании микробов, ватные пробки после посева заменяют стерильными резиновыми или надевают на них резиновые колпачки.
По потребности микробов в свободном кислороде их делят на облигатные аэробы (возбудители холеры, чумы, туберкулеза), анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой раневой инфекции, бактероиды) и факультативные анаэробы (возбудители брюшного тифа, дизентерии, стафилококки и др.). Эти группы требуют различных условий культивирования.
При культивировании аэробов и факультативных анаэробов поступление необходимого кислорода осуществляется при пассивной и активной аэрации.
Пассивная аэрация – это культивирование микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах, закрытых ватными или ватно – марлевыми пробками, а также на плотных питательных средах в чашках Петри. В этом случае микроорганизмы развиваются на поверхности среды и получают кислород непосредственно из воздуха пробирки или чашки Петри. Поэтому при поверхностном культивировании микроорганизмов стараются увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном (чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы).
На жидких средах аэробные микроорганизмы растут в виде пленок, обычно достаточно плотных. Факультативные анаэробы развиваются также и в толще жидкой среды, образуя более или менее равномерное помутнение или хлопья. Для них характерны менее плотные пленки, чем для облигатных аэробов.
Поверхностное культивирование микроорганизмов применяют в лабораториях и в промышленности.
Активную аэрацию применяют при глубинном культивировании микробов, когда их выращивают в больших объемах среды. Чтобы достаточно снабдить кислородом такие культуры, их помещают в специальные качалки – постоянное перемешивание культуры обеспечивает соприкосновение ее с воздухом. При культивировании микробов в объемах жидкости, достигающих десятков и сотен литров, используются приборы, называемые реакторами или ферменторами. Воздух продувают через культуру при помощи специальных устройств.
Культивирование анаэробов сложнее, чем аэробов, так как их необходимо лишить доступа свободного кислорода воздуха. Для этого из питательной среды удаляют воздух, применяя различные способы:
1. Удаление кислорода механическим путем. Анаэробные микроорганизмы можно культивировать в обычных чашках Петри, помещая их сразу после засева в анаэростат, из которого затем откачивается воздух. Анаэростаты – это вакуумные металлические или стеклянные эксикаторы. Металлические анаэростаты имеют герметически закрывающуюся крышку и снабжены манометром. Они способны сохранять высокое разряжение в течение длительного времени. Стеклянные вакуумные эксикаторы имеют пришлифованную крышку с краном на шлифах для откачивания воздуха. Пришлифованные поверхности эксикатора во избежание проникновения в него воздуха покрывают специальной вакуумной смазкой.
2. Замещение воздуха в анаэростате азотом, аргоном, водородом или смесью азота с углекислым газом.
3. Культивирование в высоком столбике агара с глюкозой. При этом способе микроорганизмы растут на дне, защищенные от воздуха высоким слоем среды.
4. Удаление кислорода химическим способом достигается при его окислении различных веществ кислородом, содержащимся в среде и сосудах для культивирования.
5. Метод Виньяля – Вейона заключается в том, что посев производят в пробирку с расплавленным и остуженным до 45 градусов агаром. Содержимое пробирки перемешивают и набирают в пастеровскую пипетку при помощи груши, заполняя пипетку до самого верха. Необходимо следить, чтобы в пипетку не попали пузырьки воздуха. Тонкий конец пипетки запаивают и пипетку помещают в термостат. В толще агара вырастают изолированные колонии анаэробов.
6. Добавление в среду редуцирующих (окисляющих) веществ. Используют среду Китт – Тароцци, содержащую в качестве редуцирующих веществ 0,5% раствор глюкозы, кусочки печени или яичного белка. Перед посевом среду кипятят 20 минут на водяной бане для удаления из нее растворенного кислорода. Перед посевом в пробирку на поверхность питательной среды наливают стерильное масло слоем 0,5 – 1,0 см для защиты анаэробов от проникновения кислорода.
7. Биологический метод Фортнера. В чашку Петри наливают толстым слоем агар с 5% крови. Чтобы культуры не смешивались, по диаметру чашки делают желобок в агаре. На одну половину питательной среды засевают аэробы, на другую – анаэробы. Края чашки тщательно заливают парафином. Посевы ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, а после поглощения ими кислорода, находящегося в чашке, начнут развиваться анаэробы.
Культивирование актиномицетов, грибов, микоплазм, L-форм, спирохет и простейших принципиально сходно с культивированием бактерий. Для них разработаны специальные среды и подобраны режимы, соответствующие их потребностям.
По типу питания грибы являются гетеротрофами. В качестве источника углерода грибы могут использовать большинство органических веществ. Однако, некоторые грибы лучше используют глюкозу, другие – фруктозу или пентозу. В качестве источника азота грибы могут использовать такие органические соединения как белки, пептон, пептиды, аминокислоты, соли аммония, нитраты, азот атмосферы. Диапазон использования перечисленных источников азота у разных видов грибов неодинаков.
Для роста и жизнедеятельности грибов необходимы минеральные вещества. Кроме макроэлементов (углерода, кислорода, водорода, азота, серы, фосфора, калия, кальция, магния, железа) им необходимы и микроэлементы (марганец, цинк, медь, кобальт, никель и др.).
Важную роль в физиологии грибов играют витамины. Потребность в витаминах у грибов зависит от ростовой реакции.
В отношении питательных сред большинство грибов крайне непритязательны. Они хорошо растут на самых разнообразных субстратах: картофеле, моркови, сахарном агаре, глицериновом агаре. Оптимальный рост грибов происходит при температуре 26 – 28 градусов. В зависимости от состава питательной среды особенности культуральных чвойств того или иного гриба могут варьировать.
Грибы культивируют с разными целями – для поддержания в жизнеспособном состоянии без потери функций и особенностей строения, для идентификации, получения продуктов метаболизма грибов, сохранения посевных культур и т.д. Подбор среды для культивирования грибов зависит от цели исследования и биологических особенностей микроорганизма.
Среды для культивирования грибов по составу ингредиентов бывают: 1. Природные – разнообразные субстраты растительного и животного происхождения (корнеплоды, зерно злаков, листья, стебли растений, органы и ткани животных).
2. Полусинтетические – это комбинированные среды из природных субстратов и химически известных компонентов.
3. Синтетические – состоящие из ингредиентов известного состава. Различные комбинации ингредиентов в синтетических средах и их концентраций практически не ограничены и могут служить для выяснения разнообразных процессов жизнедеятельности грибов, связанных с их ростом, размножением и физиологической активностью.
Для актиномицетов наиболее подходящими питательными средами являются щелочной глицериновый агар, картофель, сывороточные, мясные и асцитические среды, а также агар Сабуро. Посевы культивируют в аэробных и анаэробных условиях при 35 – 37 градусах не менее двух недель.
Культивирование кишечных простейших на специальных питательных средах является биологическим методом обогащения, позволяющим из единичных экземпляров паразитов получить достаточное их количество. Увеличение количества экземпляров в результате их размножения на питательной среде облегчает обнаружение и изучение паразитов.
Для культивирования кишечных амеб применяется среда, в состав которой входят четыре яйца и среда Локка (1000 мл дистиллированной воды, NaHCOз – 0,2г, хлористый кальций – 0,2г, KCl – 0,4г, NaCl – 9,0г, глюкозы – 2,5г, рН среды – 7,4). Для получения скошенной поверхности среды, пробирки в наклонном положении помещают в аппарат для свертывания и выдерживают при 70 градусах до затвердевания. Перед посевом в пробирку с плотной питательной средой добавляется несколько капель инактивированной человеческой или лошадиной сыворотки и 1 – 2 петли стерильного рисового отвара.
Для культивирования жгутиконосцев к 200 мл среды Локка добавляется одно яйцо, и полученная смесь подогревается на водяной бане в течение 15 минут. Затем смесь фильтруется через марлю, разливается по 5 – 6 мл в пробирки и стерилизуется в автоклаве под давлением в течение 20 минут.
При культивировании балантидий может быть использована среда Френкеля (4,0г аспарагина, 6,0г ammonium lacticum, 2,0г двухзамещенного фосфорнокислого калия, 5,0г NaCl, 1000 мл дистиллированной воды). Среда стерилизуется в автоклаве в течение 20 минут при 120 градусах, 1 атм. Затем к ней добавляются стерильные лошадиная сыворотка в разведении 1:10 и 2 – 3 капли крахмала (рН среды 7,2 – 7,4).
Культивирование простейших осуществляется в термостате при 37 градусах. Пересевы проводятся через день.
Риккетсии, хламидии и вирусы, являющиеся строгими внутриклеточными паразитами, совершенно не культивируются на искусственных питательных средах, используемых для культивирования бактерий, грибов, микоплазм и простейших.
Риккетсии обладают собственным метаболизмом, однако являются полностью энергетически зависимыми от тканевой клетки, поэтому риккетсии и являются внутриклеточными паразитами.. В клетке хозяина каждый вид риккетсий размножается только в определенных местах: в цитоплазме, ядре или вакуолях клеток. Риккетсии культивируются в кишечнике платяных вшей, желточном мешке развивающегося куриного эмбриона, в клетках легких белых мышей, в клетках неперевиваемых культур тканей.
У хламидий наблюдается не только энергетическая зависимость от клетки ткани, но и слабо выражена метаболическая активность. Поэтому хламидии можно культивировать только в желточном мешке развивающегося куриного эмбриона или в клетках культур тканей.
Культивирование вирусов проводится для их выделения и накопления с диагностическими целями, для последующего их изучения, для получения биологических препаратов, для изучения вирусного онкогенеза и патогенеза вирусных инфекций.
Вирусы являются строгими внутриклеточными паразитами и для их культивирования применяются (при строгом контроле) три метода:
1) в организме восприимчивого животного;
2) в развивающемся курином эмбрионе;
3) в культуре клеток.
В вирусологической практике для культивирования вирусов используют преимущественно новорожденных животных, поскольку они более чувствительны к вирусам. Этот метод имеет ограниченное применение, поскольку вирусы обладают очень выраженным специфическим тропизмом.
Куриные эмбрионы используются для культивирования только некоторых вирусов – гриппа, герпеса, натуральной и обезьяней оспы, паротита.
Наиболее широко в вирусологической практике для культивирования вирусов используются клетки культур тканей. Эти клетки по числу жизнеспособных генераций можно подразделить на три группы:
1. Первичные;
2. Перевиваемые;
3. Полуперевиваемые.
К первичным культурам относятся культуры клеток, способные выдерживать не более 5 – 10 пассажей. Их готовят преимущественно из эмбриональных тканей: почечной ткани эмбриона человека и обезьян, амниона человека, куриного эмбриона, эмбриона мышей, а также из почек взрослых обезьян.
К полуперевиваемым культурам клеток относятся культуры диплоидных клеток, получаемых из фибробластов человеческого эмбриона. Эти клетки выдерживают до 150 генераций, сохраняя исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки нашли широкое применение в вирусологии.
Перевиваемые культуры получают преимущественно из опухолевых клеток одного типа, хорошо размножающихся in vitro в течение длительного времени. К таким клеткам относятся линии, ведущие свое начало от карцином человека (HeLa, Hep -2 и др.). Основное преимущество перевиваемых линий перед первичной культурой клеток состоит в их способности размножаться в лабораторных условиях в течение длительного срока в многочисленных генерациях.
Для выращивания культур клеток любого типа необходимы питательные среды. Наиболее широкое применение нашла среда 199. В состав этой среды входят минеральные соли, глюкоза, аминокислоты, витамины, ко – ферменты и многие другие компоненты. Кроме того, в питательную среду обязательно вносят сыворотку крови и буферные растворы для поддержания стабильного рН. Чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, в среду добавляют антибиотики.
Источник
