Особенности культивирования анаэробных бактерий
Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микробов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 — 150мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс — индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин — в розовый цвет, что указывает на непригодность таких сред для культивирования облигатных анаэробов. Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризированы. Добавление даже 0,05% агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию.
Анаэробный тип энергетического метаболизма во много раз менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. В практических лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности крови (СКС), среду Китта-Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона — Блера, среду Шедлера и др. Эти свежеприготовленные питательные среды должны быть использованы для посева в течение 2-х часов во избежание насыщения кислородом.
Методы создания анаэробных условий. Создание анаэробных условий достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.
Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
1. посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.
2. посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по методу Вейнберга
Метод Вейнберга. 1-2 капли материала со среды Кита-Тароцци вносят в пробирку с МПБ для разведения. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, предварительно расплавленным и прокипяченным в течение 20 мин и остуженным до 50°С, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды, при этом агар застынет и зафиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток. Инкубируют в анаэробных условиях. Через сутки отбирают колонии, на уровне колонии пробирку распиливают, колонию отсасывают пипеткой и переносят в среду Китта-Троцци для накопления и идентификации.
3. механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы; Удаление воздуха производят путем его механического откачивания их специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толстостенный металлический или пластиковый цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
4. заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, С02) можно производить в анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Приборы и среды для культивирования анаэробов:
Микроанаэростат — используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабженный манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.
Эксикатор — стеклянный лабораторный сосуд с притертой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.
Газ-пак (Generbag anaer). Для создания анаэробных условий используются газогенераторные пакеты с реагентами — GasPak, GasPak Plus (газогенераторный пакет спалладиевым катализатором) и другие.
Винтовой зажим с герметичной прокладкой
Рис. 9 Газогенераторные пакеты
Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых емкостей, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород (рис. 9). При применении GasPak Plus необходимо увлажнить таблетку боргидрида натрия, при этом выделяется водород и в присутствии палладиевого катализатора он соединяется с кислородом с образованием воды. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и закрыть пакет. Инкубация при 37°С.
Анаэробный бокс — прозрачная плексиглассовая камера со шлюзом, отверстиями для рук с рукавами, заканчивающимися резиновыми перчатками. В нем создаются стерильные условия, его заполняют газовой смесью и поддерживают температуру 37°С.
Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.
Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45 0 полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.
Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия.
1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде.
2. Можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na2S204и 16 мл 50% КОН.
3. Использование веществ — редуцентов, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия (0,01-0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), муравьинокислый натрий (0,25-0,75%) и др.
Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.
Биологические методы
1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую — культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру “чудесной палочки” (Serratia marcescens), которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.
2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта — Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.
3. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных, однако в настоящее время этот метод используется достаточно редко.
Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза, и используются в большинстве практических лабораторий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Принцип метода заключается в использовании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.
III. План практической работы
1. Изучить аппаратуру для стерилизации, культивирования бактерий аэробов и анаэробов, зарисовать схему устройства микроанаэростата
2. Изучить технику и зарисовать схемы посевов исследуемого материала на питательные среды с целью получения изолированных колоний
3. Выписать цель и схему бактериологического метода исследования
4. Ознакомиться с питательными средами и заполнить таблицу «Питательные среды».
5. Заполните таблицу «Основные методы стерилизации»
6. Посеять смесь бактерий истощающим штрихом на МПА с целью выделения чистой культуры
7. Решить ситуационные задачи
IV. Примеры ситуационных задач
Ситуационная задача № 1
Из материала больного выделили кишечную палочку. Какие питательные среды используют для того, чтобы выделить чистую культуру и отличить ее от других представителей кишечной микрофлоры:
1. Дифференциально-диагностические среды
2. Универсальные среды
3. Среды обогащения
4. Синтетические среды
Ситуационная задача № 2
Для проведения бактериологических исследований необходимо подготовить стерильные чашки Петри, пипетки, колбы и др. посуду. Какой метод стерилизации используют:
1. Стерилизацию сухим жаром
2. Стерилизацию облучением
3. Химическую стерилизацию
4. Стерилизацию текучим паром
Ситуационная задача № 3
Из больного с опасением на анаэробную инфекцию взяли материал (раневой экссудат). Какие среды используют для культивирования возбудителя:
1. Среду Китта-Тароцци
2. Среду Вильсона — Блера
3. Среду Плоскирева
Ситуационная задача № 4
Врач-бактериолог в мазке из исследуемого материала выделил смесь нескольких микроорганизмов. Что необходимо для дальнейшей идентификации возбудителя:
1. Получение чистых культур микроорганизмов
2. Посев исследуемого материала на среду накопления
3. Произвести реакцию агглютинации с поливалентными сыворотками
4. Произвести посев материала на ряд Гиса
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).
Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.
Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.
Источник
Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований
6.3. Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий
Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необходимость применения специальных методов их культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.
Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150 мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.
Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 %-ного агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию. Для роста облигатно-анаэробных бактерий необходимо использовать только плотные свежеприготовленные питательные среды (не позднее двух часов после приготовления) или прередуцированные (выдержанные в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала, в связи с тем что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать благоприятные условия для своего роста.
Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивен, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть более насыщены питательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они содержат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и печеночный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролитический перевар казеина и др.), а также гемин, менадион, твин-80, сукцинат натрия, цельную или лизированную кровь. Для выделения различных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности (СКС), СКС-199, среду Китта – Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера и некоторые другие с соответствующими добавками.
Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является создание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.
1. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят регенерацию этих сред путем кипячения в течение 15 – 20 мин на водяной бане. Затем среды быстро охлаждают до 45 – 50 °C.
После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.
2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий столбик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в пробирки в объеме 10 – 12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5 – 2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (азотом, аргоном, гелием) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % двуокиси углерода и 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистральный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси применяют палладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата помещают хлористый кальций, силикагель или хлористый натрий.
1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода используют смесь раствора пирогаллола и насыщенного раствора карбоната натрия (Nа2CO3).
2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия.
3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста анаэробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и др.
4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах).
Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия. Этот метод особенно удобен при работе в полевых условиях.
1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру Serratia marcescens, которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.
2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.
В большинстве практических лабораторий применяют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Метод основан на создании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.
Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрывают резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддерживается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.
Источник
