Стафилококковый анатоксин микробиология способ получения

Способ получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией

Изобретение относится к медицинской микробиологии, фармацевтической промышленности, в частности к способам получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, используемого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией. Препарат применяют для иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией и для лечения больных, не чувствительных к антибиотикам, или больных стафилококковой инфекцией, у которых антибиотики вызывают аллергические реакции. Способ включает перевод токсина в анаформу посредством обработки формальдегидом, очистку анатоксина путем обработки сухим хлоридом натрия, осаждение трихлоруксусной кислотой, сепарацию, растворение осадка в 0,9%-ном растворе хлорида, обрабатывают этиловым спиртом, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия до содержания 12 ЕС в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%. Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ дает возможность получить стафилококковый анатоксин, очищенный от балластных веществ, не реактогенный, не вызывающий аллергических реакций. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, фармацевтической промышленности, в частности, к способам получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, используемого для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией.

Известен способ получения анатоксина стафилококкового нативного, включающего выращивание микробной массы в термостате, сепарацию микробной массы, получение токсина и перевод его в анаформу с последующей стерилизующей фильтрацией (1).

Однако этот препарат не очищен от балластных белков и имеет в конечном продукте процент формальдегида, превышающий норму (0,006-0,007%), что вызывает аллергические реакции; и он недостаточно иммуногенен.

Целью предлагаемого изобретения является получение анатоксина стафилококкового, очищенного от балластных белков, не реактогенного, с содержанием формальдегида не более 0,003%, не вызывающего аллергических реакций, высокоиммуногенного.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что микробную массу выращивают, сепарируют, переводят в анаформу путем добавления формальдегида, обрабатывают сухим химически чистым натрием хлорида, осаждают, сепарируют, центрифугируют и доводят 0,9%-ным раствором натрия хлорида до нужной концентрации (122) единиц связывания (ЕС) в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%.

Пример 1. Микробную массу культуры стафилококка (производственный штамм Staphylococc 0-15) выращивают в термостате и на шутель-аппарате, что сокращает период выращивания биомассы на 5 суток, сепарируют; полученный токсин переводят в анаформу путем добавления формальдегида.

Обезвреженный анатоксин подвергают очистке. В бутыли с анатоксином добавляют сухого химически чистого натрия хлорида и после того, как соль растворится, бутыли помещают на (222) ч в холодную камеру, затем осаждают 1 н. трихлоруксусной кислотой и сепарируют. Осадок с поверхности сепаратора тщательно смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида, получая приблизительно 1/30 первоначального объема анатоксина. Концентрат помещают в холодную камеру при 0 o C на 20 ч.

В охлажденный концентрат стафилококкового анатоксина при тщательном перемешивании добавляют 2,5 объема этилового спирта, охлажденного до -20 o C. Образовавшийся после добавления спирта осадок отделяют на центрифугах при 2,5 — 3 тысячах оборотах в минуту. Вновь полученный осадок растворяют в охлажденном до 0 o C стерильном 0,9%-ном растворе натрия хлорида, сливают в бутыль и добавляют 0,9%-ный раствор натрия хлорида до объема концентрата, полученного после первого осаждения, доводят 15%-ным едким натром (NaOH) pH до 6,70,2 и оставляют во фриго при (73) o C на 20 ч.

Центрифугирование растворенного осадка проводят для лучшей очистки надосадочной жидкости с целью более свободной фильтрации через свечи. Надосадочную жидкость собирают в бутыль. Полученный концентрированный стафилококковый анатоксин подают на стерилизующую фильтрацию через свечи Ф-5.

Концентрированный очищенный стафилококковый анатоксин (АСО), содержащий не менее 30 ЕС (единиц связывания) в 1 мл разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до содержания в 1 мл (122) ЕС. Остаточный формальдегид не более 0,003%. Полученный препарат применяется для специфической иммунотерапии больных стафилококковой инфекцией, для лечения больных стафилококковой инфекцией, не чувствительных к антибиотикам или больных, у которых антибиотики вызывают аллергические реакции.

Пример 2. Препарат вводят 67 добровольцам в возрасте 22-54 лет подкожно в область нижнего угла лопатки в объеме 0,5 мл 3-кратно с интервалом между I и II инъекциями 5 дней, между II и III инъекциями — 20 дней.

На введение препарата местные реакции отмечены у 12 человек в виде незначительной гиперемии и малоболезненного уплотнения в месте введения анатоксина.

У 6 человек из этих 12 имели место слабые общие реакции: легкое недомогание, субфебрильная температура. Все указанные симптомы исчезали в течение 24-36 ч после введения препарата. У остальных 55 человек никаких неприятных ощущений, связанных с введением анатоксина, не отмечено.

Изучение иммунологической эффективности АСО, выраженной в Международных единицах (ME) проводят путем титрования антитоксина в сыворотках привитых методом торможения гемолиза (2).

Исследования проводят в следующие сроки: 1 — до начала иммунизации (исходный титр), II — через 20 дней после 2-ой инъекции препарата. III — через 2 месяца после окончания иммунизации. Исходные титры антитоксина у добровольцев были следующие: 0,25 ME — у 18 человек, 0,5 ME — у 22 человек, 1,0 ME — у 16 человек, 2,0 ME — у 9 человек, 4,0 ME — у 2 человек.

Кратность изменения титров антитоксина по отношению к исходным у добровольцев в процессе иммунизации представлена в таблице.

Представленные данные показывают, что после 2-ой прививки уровень антитоксина увеличился у 41 человека (61%), причем у 28 добровольцев (42%) он вырос значительно (в 8-32 раза).

Через 2 месяца после окончания иммунизации титры антитоксина увеличились по сравнению с исходными у 64 человек (96%), из числа которых у 40 человек (60%) имело место выраженное нарастание уровня антител (в 8 и более раз).

Анатоксин стафилококковый очищенный жидкий продемонстрировал высокую иммуногенность, отсутствие реактогенности и аллергических реакций, которые имели место в анатоксине стафилококковом нативном.

5. Пример 3. 165 женщинам с острыми и подострыми заболеваниями внутренних гениталий и 150 женщинам с часто рецидивирующими хроническими заболеваниями проводят комплексное лечение с использованием АСО.

Соответствующее распределение в контрольной группе составляет 420 и 260 пациенток. Введение женщинам АСО начинают с первых дней поступления в стационар при подостром течении или по стихании острых явлений.

Препарат вводят под кожу паховой складки бедра (зоны Захарьина-Геда) один раз в 3 дня в следующих нарастающих дозах: 0,1-0,3-0,5-0,7-0,9-1,2-1,5-1,7-2,0 мл.

Под влиянием проводимой иммунотерапии у большинства пациенток уже после третьей инъекции АСО улучшалось общее состояние, после четвертой-пятой нормализовалась температура, исчезали очаговые реакции, воспалительные опухоли придатков и инфильтраты значительно уменьшались в размерах, контуры их отграничивались, матка становилась подвижной.

Полученный эффект позволяет сократить пребывание женщин в стационаре и ограничить число инъекций АСО в клинике до 3-4. Последующие инъекции препарата осуществляют в амбулаторных условиях.

Применение АСО в обеих группах обследованных дает 100%-ный клинический эффект, причем у подавляющего большинства больных (82,7-97,6%) наступает выздоровление. В контрольных группах — у 5,2-11,3% больных эффекта не наблюдалось, а количество выздоровевших составило лишь 45,8 — 61,3%. Применение АСО позволяет сократить среднюю длительность пребывания больных в стационаре в 1,5-1,8 раза.

При оценке отдаленных результатов терапии показано, что в течение 48 месяцев по окончании лечения число рецидивов заболевания в группах больных, получавших АСО, было в 10 раз меньше, чем в группах больных, подвергнутых обычной противовоспалительной терапии.

Таким образом, анатоксин стафилококковый очищенный жидкий является высоко иммуногенным препаратом, не вызывающим аллергических реакций при лечении больных стафилококковой инфекцией.

Список литературы 1. Г. В. Выгодчиков «Стафилококковые инфекции». Государственное издательство медицинской литературы, Москва, 1963 г.

2. «Методические указания по лабораторной диагностике стафилококковых инфекций», Москва, 1963 г.

Способ получения анатоксина стафилококкового очищенного жидкого, включающий выращивание микробной массы, сепарацию, перевод в анаформу путем добавления формальдегида, отличающийся тем, что анатоксин подвергают очистке путем обработки сухим химически чистым натрием хлорида, осаждают трихлоруксусной кислотой, сепарируют, осадок смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида, помещают при 0 o C на 20 ч в охлажденный концентрат, добавляют этиловый спирт при -20 o C, образовавшийся осадок центрифугируют и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия и доводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия до нужной концентрации (12 2) ЕС в 1 мл при остаточном формальдегиде не более 0,003%.

PD4A — Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (RU)

Адрес для переписки:123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Источник

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/85

Описание патента на изобретение RU2377013C1

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии изготовления биопрепаратов для специфической профилактики и лечения болезней животных стафилококковой этиологии.

Известные способы получения инактивированных вирусных и бактерийных вакцин, анатоксинов основаны на использовании 0,8±0,2% раствора формалина, УФ-лучей, ионизирующих лучей и пр. (Шапиро Я.С. «Микроорганизмы — вирусы бактерии грибы». Издательство «ЭЛБИ». — СПб, 2003 г., с.156-160).

Недостатком указанных способов является проведение детоксикации стафилококковых экзо- и эндотоксинов с помощью 0,8±0,2% раствора формалина, который является канцерогенным и практически не обеспечивает детоксикацию суперэнтеротоксинов и соответственно не превращает их в анатоксины (Коротяев А.И., Бабичев С.А. «Медицинская микробиология, иммунология и вирусология». Санкт-Петербург, издательство «Специальная литература», 1998 г., с.333).

Поиск более эффективных и безвредных детоксикаторов с использованием жирных кислот, перекиси водорода, антибиотиков, фотоокисления, нингидрида, тирозина, Р-пропилактона носил случайный характер и не получил признание.

В то же время в Японии в основу изготовления столбнячного, стафилококкового и стрептококкового анатоксинов положено использование в качестве детоксикатора глюкуроновой кислоты, глюконата и глюкороната натрия (патент №23345 с приоритетом от 06.12.1961 г.).

При этом в отношении стафилококковых суперэнтеротоксинов детоксицирующее действие указанных инактиваторов (детоксикаторов) не указывается, хотя они являются сильнейшими пищевыми ядами и проявляют устойчивость к формалину и температуре.

Следует указать, что термин суперантигены (САГ) используется для определения глобулярных белков-молекул, продуцируемых патогенными микроорганизмами, обладающих пирогенным (эритрогенным) и митогенным действием, способных вызывать артриты, кожные поражения, СПИД, усиливать патогенез и пр.

За прототип взят «Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины» (RU 2139091, 10.10.1999), включающий выращивание стафилококков, их стерилизацию, поэтапную детоксикацию формалином: добавление формалина вначале до концентрации смеси 0,3-0,4% с инкубацией при температуре 37-40°С в течение 7-10 суток, а затем — до конечной концентрации 0,5-0,8% с последующей инкубацией при температуре 44-46°С в течение 5-8 суток, сорбцию на гидроксиде алюминия до концентрации 1 мг/мл и стерилизацию автоклавированием.

Недостатком указанного способа является проведение детоксикации стафилококковых токсинов одним детоксикатором — формалином, который не обеспечивает полноту инактивации всех видов токсинов, и соответственно не может превратить суперэнтеротоксины в анатоксины.

Сравнительная оценка вышеуказанных детоксикаторов и испытание новых выявили эффективность ряда бисчетвертичных аммониевых соединений, в частности этония, который был взят за основу получения стафилококковой анатоксин-вакцины.

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности и безопасности анатоксин-вакцины посредством детоксикации стафилококковых токсинов двумя детоксикаторами в два этапа — первоначально 0,2% раствором формалина, вместо 0,8% в течение 9-10 суток, а затем 0,6±0,1% раствором этония в течение 7-9 суток при 40-45°С.

Поставленная цель достигается снижением концентрации канцерогенного и неэффективного в отношении стафилококковых суперэнтеротоксинов формалина с 0,8±0,2% до 0,2% и последующим прибавлением 0,6±0,1% этония для полной и необратимой детоксикации всех видов токсинов, сорбцией на гидроксиде алюминия из расчета 1-3 мг/мл и декантацией 50% надосадочной жидкости.

При этом исходная концентрация формалина снижается с 0,2% до 0,1% из-за связывания с белковыми молекулами токсинов, а безвредность этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид-бисчетвертичное аммониевое соединение) доказана многолетним использованием его в виде 0,5-1% раствора, мазей и пр. в гуманной медицине в стоматологии, офтальмологии, дерматологии и т.д.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены технические решения, аналогичные заявляемому с использованием этония.

Применение 0,6±0,1% раствора этония при снижении концентрации формалина с 0,8±0,2% до 0,2% в предложенном способе позволяет достичь полной и необратимой детоксикации стафилококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов и получения безвредной и эффективной стафилококковой анатоксин-вакцины.

Установленная возможность полной и необратимой детоксикации комплекса стафилококковых экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов путем использования на первом этапе 0,2% раствора формалина вместо 0,8%, а во втором этапе 0,6±0,1% этония, сорбции на гидроксиде алюминия, декантации 50% надосадочной жидкости позволила разработать оптимальную схему технологического процесса для получения стафилококковой анатоксин-вакцины в промышленных условиях.

Предполагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины

Выращенные стафилококки с экзо- и эндотоксинами на жидкой синтетической среде в 2-литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, в течение 12±2 суток до 10,0±2,0 млрд/см 3 суспензии микроорганизмов подвергли автоклавированию при 1,0 атм в течение 30 минут, далее проводили детоксикацию комплекса токсинов первоначально 0,2% раствором формалина в течение 9-10 суток при 40-45°С, а затем 0,6±0,1% раствором этония при 40-45°С в течение 7-9 суток. После детоксикации проводили сорбцию на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и увеличивали концентрацию инактивированных токсинов с микроорганизмами декантацией 50±5% надосадочной жидкости.

Полученную анатоксин-вакцину расфасовывали в 20, 100 и 200 мл флаконы и подвергали стерилизациии при 1,0 атм в течение 20 минут.

Определение безвредности стафилококковой анатоксин-вакцины (CAB)

Изучение токсичности CAB проводили на 12 белых мышах массой 20±2,0 г путем внутрибрюшинного (6го.л) и подкожного (6гол.) введения по 1,0 мл биопрепарата.

Все животные без видимых некротических, воспалительных процессов и общего токсикоза оставались живыми при наблюдении в течение 15 суток.

Испытание безвредности на собаках

Для исследований использовано 6 беспородных щенков в возрасте 2-3 месяцев массой 3-4 кг. Подопытным животным одновременно подкожно и внутримышечно ввели по 5 мл CAB. В течение 15 суток все животные оставались живыми, а на месте введения биопрепарата не отмечено воспалительных и гнойно-некротических поражений.

Сравнительная оценка эффективности лечения ожоговых ран у свиней

Ожог кожи у поросят в размере 7-10 см получали путем приложения на 5-7 минут нескольких слоев марли, смоченной 5% раствором карболовой кислоты, — 18 голов.

Лечение проводили в виде примочек два раза в день с помощью 2-х вариантов стафилококковой анатоксин-вакцины, полученных с помощью детоксикации токсинов 0,8% раствором формалина (1-й контрольный вариант) и 0,2% раствором формалина с 0,6% раствором этония (испытуемый вариант). При этом установлено, что грануляционная ткань у поросят при лечении испытуемым вариантом анатоксин-вакцины проявлялась на 2-3 дня раньше, чем у контрольной, грануляция всей раневой поверхности происходила к 20-22 дню лечения, а при лечении ожоговых ран контрольной вакциной к 25-27 дню. Следовательно, при лечении ожоговых ран у свиней стафилококковой анатоксин-вакциной, полученной с помощью этония, процесс заживления ран завершался на 3-5 суток раньше, чем при использовании формолвакцины.

Сравнительная эффективность стафилококковой анатоксин-вакцины с этонием

В исследованиях использовано 45 коров, больных катаральным и гнойно-катаральным маститом (от гр. mastos — грудь, сосок и фр. caftare — воспаление слизистой оболочки). При бактериологическом исследовании молока больных коров были выделены культуры золотистого стафилококка — S. aureus.

Больные животные были разделены на три группы по 15 коров.

В качестве контроля использовали в первом контрольном опыте формоланатоксин-вакцину, во втором мастисан-А, содержащий в суспензии подсолнечное масло, пенициллин, стрептомицин, норсульфазол и воск. Перед введением препаратов из вымени сдаивали молоко, сосок протирали 70% спиртом. Мастисан-А вводили интрацистернально ежедневно по 15 мл, а формолвакцину и стафилококковую анатоксин-вакцину с этонием по 4-5 мл. При этом установлено, что при лечении коров, больных маститом, CAB с этонием выздоровело за 6-7 суток, 13 коров и 2 коровы выздоровели через 9 суток, при лечении CAB с формалином успех лечения был достигнут только через 9-10 суток, а при использовании мастисана через 11-12 суток. Существенным недостатком при лечении коров мастисаном-А является наличие в препарате антибиотиков, которые выделяются с молоком во время лечения и после прекращения введения препарата.

Похожие патенты RU2377013C1

название	год	авторы	номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛО-СТРЕПТОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Майстренко Лариса Анатольевна	RU2377016C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2011	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Худяков Сергей Иванович Поздеев Александр Владимирович Тагирмирзоев Багир Маилович	RU2468078C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Майстренко Лариса Анатольевна	RU2377014C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛИСАЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Смирнов Максим Александрович Разинькова Ирина Александровна Стрикалова Елена Алексеевна	RU2371197C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Майстренко Лариса Анатольевна	RU2386448C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Коломиец Владислав Михайлович Евглевский Дмитрий Анатольевич Тимкова Елена Анатольевна Епифанова Светлана Юрьевна	RU2392002C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ ВАКЦИНЫ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Разинькова Ирина Александровна	RU2392003C2
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ БИОЦИДНОЙ И ЛЕЧЕБНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2014	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Жеребилов Николай Николаевич	RU2562585C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Коломиец Владислав Михайлович Евглевский Дмитрий Анатольевич Тимкова Елена Анатольевна Епифанова Светлана Юрьевна	RU2360697C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛИБАКТЕРИОЗНОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ	2008	Евглевский Анатолий Алексеевич Евглевский Дмитрий Анатольевич Смирнов Максим Александрович	RU2372937C1

Реферат патента 2009 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Стафилококковую анатоксин-вакцину получают путем детоксикации стафилококковых экзо- и эндотоксинов двумя детоксикаторами — 0,2% раствором формалина в течение 7-9 суток при 40-45°С, а затем 0,6±0,1% раствором этония в течение 7-9 суток при 40-45°С. При этом происходит полная детоксикация токсинов и инактивация их аллергенных свойств при практически 100% расходовании формалина и этония. Затем производят сорбцию стафилококковой анатоксин-вакцины на 1-3 мг/мл гидроксида алюминия и вдвое увеличивают концентрацию инактивированных токсино-аллергенов путем декантации 50±5% надосадочной жидкости. Изобретение применяется для ускоренного заживления ран, лечения дерматитов, пневмонии телят, поросят, профилактики стафилококкоза птиц.

Формула изобретения RU 2 377 013 C1

Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины, включающий поэтапную детоксикацию туберкулезных экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов в суспензии с автоклавированными стафилококками, сорбцию анатоксина на гидроксиде алюминия, стерилизацию, отличающийся тем, что детоксикацию стафилококковых токсинов проводят двумя детоксикаторами — первоначально 0,2%-ным раствором формалина в течение 7-9 суток при 40-45°С, а затем 0,6±0,1%-ным раствором этония в течение 7-9 суток при 40-45°С, при этом концентрацию инактивированных токсинов с микроорганизмами увеличивают вдвое декантацией 50±5% надосадочной жидкости.

Источник