Способы выведения чистых культур

Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Метод Пастера (метод предельных разведений).Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред.К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре. С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке. Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала. Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха). Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов. После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

Биологические методы выделения чистых культур патогенных микроорганизмов основаны на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, восприимчивых к данному виду возбудителя. Если патогенный микроорганизм содержится в исследуемом объекте, то лабораторное животное заболевает и погибает. После вскрытия павшего животного из внутренних органов делают посевы на специальные среды, на которых вырастают чистые культуры выделяемых микробов.

Дата добавления: 2016-02-27 ; просмотров: 10784 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

8. Методы выделения чистых культур микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной сре­ды, сильно зависит от физических и химических факторов (температура, кислотность, аэрация, свет и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболиз­ма каждой группы бактерий. Существуют методы культивирования мик­роорганизмов на твердых и в жидких питательных средах в аэробных, анаэробных и других условиях.

Методы выделения чистых культур аэробных микроорганизмов. Для того, чтобы получить изолированные колонии, при нанесении материал распределяют так, чтобы клетки бактерий были удалены друг от друга. Для получения чистой культуры используют две основные группы методов:

а) мето­ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов;

б) методы, основанные на биологиче­ских свойствах микроорганизмов.

Методы, основанные на принципе механического разде­ления микроорганизмов

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.

Метод Пастера (метод разведений).Из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных серийных разведений в жидкой стерильной среде или физиологическом растворе в пробирках. Далее высевают материал газоном по 1 мл из каждой пробирки. Предполагают, что в какой-то из пробирок останется количество микроорганизмов, поддающихся подсчету при высеве на пластинчатые среды. Этот метод дает возможность подсчитать микробное число в исследуемом материале. (Микробное число — количество колоний на последней чашке с ростом микроорганизмов, умноженное на степень разведения материала).

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды Метод Коха (метод заливок).Исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С МПА, перемешивают, затем каплю питательной среды с разведенным материалом переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т.д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Приготовленные разведения мик­робов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения мате­риала.

Рассев петлей (посев штрихами).Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Метод фильтрации.Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа­щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при­меняется главным образом для очистки вирусов от бак­терий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате — чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах мик­роорганизмов

Создание оптимальных условий для размножения

Создание оптимального температурного режима для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры при низкой температуре и получения культур психрофильных или термофильных бактерий. Большинство микробов неплохо развиваются при 35-37°С, иерсинии хорошо растут при 22°С, лептоспиры культивируют при 30°С. Термофильные бактерии растут при температурах, лежащих за пределами температурных режимов прочих сопутствующих видов бактерий (так, кампилобактер культивируют при 42°С).

Создание условий для аэробиоза или анаэробиоза. Большинство микроорганизмов хорошо растут в присутствии атмосферного кислорода. Облигатные анаэробы растут в условиях, исключающих присутствие атмосферного кислорода (возбудители столбняка, ботулизма, бифидумбактерии, бактероиды и др.). Микроаэрофильные микроорганизмы растут только при низком содержании кислорода и повышенном содержании СО₂(кампилобактер, геликобактер).

Метод обогащения. Исследуемый материал за­севают на элективные питательные среды, способствую­щие росту определенного вида микроорганизмов.

Метод Шукевича.Исследуемый ма­териал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру. Так, для выделения культуры Proteus vulgaris, Clostridium tetani материал засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенной плотной средой, не касаясь поверхности среды. Названные микроорганизмы способны давать ползучий рост (роение) на поверхности среды. Сопутствующие микробы растут в нижней части питательной среды, а протей и столбнячный микроб в виде пленки распространяются вверх и занимают всю скошенную часть агара.

Метод прогревания.Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогрева­ют исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10—15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую пи­тательную среду прорастают.

Бактериостатический метод (метод ингибирования).Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроор­ганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомици­на позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры. Серная кислота (5% раствор) быстро убивает боль­шинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка вы­живает в этих условиях. Необходимо учитывать, что селективные факторы часто включены в состав среды в бактериостатических концентрациях, поэтому сопутствующие микрооорганизмы остаются жизнеспособными и при переносе колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Метод заражения лабораторных животных. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделе­ния их от сапрофитной флоры. Для заражения подбира­ют наиболее восприимчивые к предполагаемому возбу­дителю инфекции виды животных. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и един­ственным. Биопроба – метод, который позволяет не только выделить возбудитель из патологического материала, но также изучить вирулентность чистой культуры. Организм животного представляет собой биологический «фильтр», который в силу выраженности своих защитных свойств уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий. Биопроба проводится при выделении чистой культуры пневмококка, микобактерий туберкулеза, франциселл и т.п.

Источник

Особенности и принципы выделения чистых культур бактерий

Чистой культурой считается совокупность микроорганизмов, принадлежащих к одному виду. Получение данного материала является необходимым моментом исследования в выполнении лабораторных диагностических методик. Для выделения чистых культур бактерий используют мазки из крови, мокроты, фекалий, исследуют гнойный, а также другой биологический материал. В естественных условиях (в воздухе, воде, почве), продуктах пищевого назначения, в трупах (человеческих, животных) содержатся ассоциации различных видов микроорганизмов.

Отделение чистой культуры важно для подробного изучения свойств микробов: морфологических, культуральных, биохимических, а также антигенных. По результатам данных методик исследования можно установить принадлежность возбудителя к определенному виду и типу, иными словами, выполнить его идентификацию.

Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры

Принципы биологического разъединения бактерий подразумевают учет особенностей жизнедеятельности микробов с целью выбрать наиболее оптимальные методы исследования. Выбранные методы должны соответствовать возбудителю по определенным параметрам.

1. Тип дыхания. Среди бактерий выделяют группы аэробных и анаэробных представителей. Для получения анаэробных микробов материал для исследования прогревают. Следующий этап – культивирование микроба в анаэробных условиях. Методики получения аэробных и анаэробных бактерий различны.
2. Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
3. Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот. Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов щелочи либо кислоты.
4. Подвижность бактериальных организмов. Для отделения чистой культуры подвижных микроорганизмов используются методы отделения культур микробов в капле конденсата.
5. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее предпочтительны методы выделения культур с применением селективных (специфических) питательных сред.
6. Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
7. Способность бактерий проникать сквозь неповрежденные кожные покровы. Это свойство присуще некоторым разновидностям, которые обладают факторами агрессии.
8. Чувствительность животных к некоторым болезням инфекционного генеза.

Методики проведения оценки возбудителя

Для получения чистых культур бактериальных клеток применяется ряд методов. Каждый из них применяется в той или иной ситуации и имеет последовательные четкие этапы получения колоний возбудителя заболевания. Рассмотрим наиболее популярные.

Методика Пастера

Представляет собой разведение чистых культур в среде для бактериального роста (жидкой консистенции) до получения концентрации с 1 клеткой на объем жидкости. Данный метод выделения имеет важнейшее историческое значение.

Методика Коха

Известна также как методика «пластинчатых разводок». Представляет собой разведение материала для исследования в агаре (в расплавленном состоянии с температурой 48-50°С). Далее полученный состав разливают по чашкам Петри, где он должен застыть.

Посевы обычно проводят с 3-4 последних разведений, так как бактерий там уже мало. Таким образом, при росте микробов на питательной среде проявляются обособленные колонии микроорганизмов, которые рождаются из единственной материнской клетки. Затем из глубины агара можно выбрать изолированную колонию, и пересеять ее на свежую питательную среду. Следующий этап – идентификация и выделение возбудителя.

Методика Шукевича

Используется при необходимости выделить чистую культуру аэробов протея либо каких-либо других микробов, характеризующихся «ползучим» ростом. Сеют культуры на воду, конденсированную у основания скошенного агара.

При данном методе отделения чистой культуры подвижные клеточные организмы (протей) поднимаются на верхушку скошенного агара, а неподвижные формы не меняют своего расположения на среде посева. Путем пересевания верхних краев проросшей культуры, можно вывести чистую бактериальную культуру.

Методика Дригальского

Способ Дригальского довольно широко используется в исследовании биологического материала путем разведения культур в пробирке с бульоном либо с физиологическим раствором.

Следующий этап: одну каплю полученного раствора при помощи стерильного шпателя из стекла распределяют равномерно по поверхности среды питания в 1-ой чашке. Потом, не прожигая шпатель на огне, делают им же посев на 2-ой и 3-ей чаше. Суть метода Дригальского заключается в том, что с каждым последующим посевом культур концентрация бактерий (аэробов) все меньше. На 3-ей чашке они распределяются довольно обособленно, каждая бактериальная клетка при этом дает клональные клетки (в виде изолированной колонии). Их пересевают на скошенный агар для накопления возбудителей.

Методика Вейнберга

Определенные затруднения вызывает выделение чистых культур анаэробных возбудителей, если микроорганизмы не гибнут при контакте с кислородными молекулами. Суть методики заключается в выведении анаэробных микробов (в составе материала) в слегка остывшей (45-50°С) расплавленной среде питания (агарозированной). Проводят 6-10 разведений. Затем идет следующий этап: необходимо быстро охладить состав в пробирке и залить ее поверхность смесью из масла вазелина и парафина, что препятствует проникновению воздуха и способствует развитию анаэробных условий.

При благоприятном посеве прорастают изолированные колонии на второй день, которые можно извлечь из пробирки путем ее нагревания при помощи горелки. Из разрезанного агарового столбика петлей набирают культуры для дальнейшего исследования. Полученные колонии размещают в жидкую питательную среду, на чем этапы выделения колонии анаэробных возбудителей можно завершить.

Методика Хангейта

Ее часто применяют для выделения аэробных микробов, обладающих высокой кислородочувствительностью. В проведении такого выделения культуры аэробов применяется методика вращения пробирок.

Методы засевания аэробных бактерий предполагают выведение их на агаризированной расплавленной среде. Наличие инертного газа в пробирке дает возможность вырастить изолированные колонны аэробных бактерий таким образом, что выделенные культуры аэробов хорошо можно увидеть даже невооруженным глазом на 2-3 день.

Микроманипулятор

Это методика выделения отдельных бактериальных клеток путем применения микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой специальный прибор, которым можно выловить из суспензии одну клетку, а также обеспечить возможность посева культуры в пробирку.

Дальнейшая идентификация возбудителя проводится с учетом всех перечисленных свойств возбудителя (аэробов и анаэробов), а также особенностей их взаимодействия с различными веществами.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник