Способы выделения нуклеиновых кислот

Методы выделения нуклеиновых кислот

При изучении химического состава и строения нуклеиновых кислот перед исследователем всегда стоит задача выделения их из биологических объектов. Нуклеиновые кислоты являются составной частью сложных белков – нуклеопротеинов, содержащихся во всех клетках животных, бактерий, вирусов, растений. Нуклеиновые кислоты обладают сильно выраженными кислыми свойствами (обусловлены остатками ортофосфорной кислоты в их составе) и при физиологических значениях рН несут отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важных свойств нуклеиновых кислот – способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками (гистонами), ионами металлов (преимущественно с Mg 2+ ), а также с полиаминами. Поэтому для выделения нуклеиновых кислот из комплексов с белками необходимо, прежде всего, разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот. Для этого измельченный путем гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми растворами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеиновых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например додецилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фенольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом удается получить очищенные препараты нуклеиновых кислот.

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата, полученного описанным методом. Это, прежде всего, хроматография на геле фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-электрофорез и др.

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной кислотой.

Источник

#13 Очистка нуклеиновых кислот: многообразие методов и подходов

Одной из базовых методик практически в любом эксперименте является выделение нуклеиновых кислот. Причем, зачастую, от качества выделенной нуклеиновой кислоты зависит успех всего дальнейшего эксперимента, поэтому к подбору реагентов для экстракции НК стоит подходить ответственно. Мы решили рассмотреть различные технологии выделения НК, их особенности, преимущества и недостатки, чтобы вы смогли подобрать идеальное решение для ваших индивидуальных задач.

Методы выделения НК, применяемые в современных коммерческих наборах

Впервые нуклеиновые кислоты были выделены швейцарским физиологом Фридрихом Мишером в 1869 году. Он изучал химический состав животных клеток и заметил, что из ядер лейкоцитов можно выделить некое неизвестное ранее вещество – «нуклеин». Позже, благодаря кислотным свойствам этого вещества, его стали называть «нуклеиновая кислота». Технология выделения НК Фридриха Мишера была очень трудоемкой, она включала много сложных этапов и занимала несколько дней.

Спустя 100 лет после открытия нуклеиновых кислот исследователи по всему миру стали широко использовать технологию фенол-хлороформного выделения .

Рис.1 Схема протокола выделения НК фенол-хлороформным методом.

В данной методике образец лизируют, а затем лизат смешивают с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом. После центрифугирования эта смесь разделяется на две фазы, причем в нижней органической фазе остаются все жиры и липиды, в интерфазе – белки, а в верхней водной фазе – нуклеиновые кислоты (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз и таким образом получают выделенные и очищенные НК.

Метод фенол-хлороформной экстракции широко распространен благодаря своей дешевизне, но он всё же уступает другим технологиям по качеству и выходу НК, а также требует сложных и длительных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать.

В 1979 году американские учёные продемонстрировали, что при определённых условиях НК способны связываться с силикатами, что позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики, со связанными НК. Их открытие легло в основу двух технологий: выделения НК на спин-колонках и на магнитных частицах.

Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении лизированного образца на колонку и последующем центрифугировании НК остаются на кремниевой мембране колонки, а все остальные компоненты образца проходят сквозь неё (Рис.2). Затем НК можно промыть и элюировать в пробирку для сбора образца.

Рис.2 Схема протокола выделения НК на спин-колонках.

Основные преимущества метода — чистота и высокое качество выделенных нуклеиновых кислот, высокая воспроизводимость и простота по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено.

Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках становится популярным более быстрый способ выделения на магнитных частицах . Технология этого способа экстракции основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы.

Рис.3 Схема протокола выделения НК на магнитных частицах.

К лизированному образцу добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания НК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют (Рис.3).

Этот метод так же хорош, как и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не нужно сложное оборудование (например, центрифуга), а сам процесс легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой технологии.

Вы можете найти наборы для выделения НК от SkyGen у следующих брендов:

Наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках	Наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и магнитных частицах, а также на технологии SmartExtraction	Наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и магнитных частицах	Наборы основаны на технологии ферментативной температурно-зависимой экстракции

Наборы для выделения НК от компании New England Biolabs

Американская компания New England Biolabs представляет линейку наборов Monarch® для выделения и очистки нуклеиновых кислот:

T3010 L/S

Набор Monarch® для выделения геномной ДНК
(150/50 реакций) T1030 L/S

Набор Monarch® для очистки ДНК-продуктов ПЦР и ферментативных реакций
(250/50 реакций) T1020 L/S

Набор Monarch® для выделения ДНК из агарозного геля
(250/50 реакций) T1010 L/S

Набор Monarch® для выделения плазмидной ДНК, 20 мкг
(150/50 реакций) T2030, T2040, T2050 L/S

Набор Monarch® для очистки РНК-продуктов ферментативных реакций
(100/10 реакций)

Все наборы основаны на технологии выделения НК на спин-колонках и позволяют получить экстракт очень высокого качества.

Основываясь на собственном опыте и отзывах наших клиентов, мы рекомендуем использовать набор Monarch® (Т3010 L/S) для выделения геномной ДНК для дальнейшего секвенирования на платформах Oxford Nanopore Technology (MinION, GridION, PromethION).

Вы можете узнать подробнее об особенностях и преимуществах этого набора в нашем обзоре.

Продукция для выделения НК от компании Analytik Jena

Все наборы для выделения НК от немецкой компании Analytik Jena основаны на технологии двойной химии (Dual Chemistry Technology, DC-Technology), которая была разработана и запатентована в 2005 году. Она основана на использовании буферов с содержанием хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой в определенной комбинации. Это позволяет НК прочнее связываться с твердой фазой, а также сокращать время выделения благодаря более эффективному лизису.

innuPREP и blackPREP — линейки наборов для выделения НК на спин-колонках из широкого спектра образцов. В линейке blackPREP представлены колонки чёрного цвета, других отличий от innuPREP у этой линейки нет.

В данных линейках представлены наборы для выделения НК из следующих типов биологических образцов:

• Кровь
• Ткани, клетки и мазки
• Бактерии
• Криминалистические образцы
• Вирусные НК из биологических жидкостей, тканей и мазков
• Растения
• Фекалии
• Образцы пищи
• Клещи
• Фрагменты хвостов грызунов
• Мазки буккального эпителия
• Парафиновые срезы = FFPE
• Гели и смеси

Для использования наборов innuPREP и blackPREP потребуется следующее оборудование:

• Дозаторы
• Вортекс
• Термошейкер
• Центрифуга до 10.000 g (

innuSPEED – линейка наборов для выделения НК на спин-колонках из сложнолизируемых образцов. Данная панель адаптирована под этап механического лизиса на гомогенизаторе (можно заменить на вортекс) в специальных пробирках с шариками. Такие пробирки со стеклянными, керамическими или стальными шариками различного размера уже входят в состав наборов, а также их можно приобрести отдельно и комбинировать с любыми другими наборами.

Наборы innuSPEED позволяют выделять НК из следующих образцов:

Для использования наборов innuSPEED потребуется следующее оборудование:

• Дозаторы
• Вортекс
• Гомогенизатор SpeedMill (или любой другой, а также можно заменить на вортекс)
• Термошейкер
• Центрифуга до 10.000 g (

Наряду с DC-Technology компания Analytik Jena разработала технологию SmartExtraction , которая основана на связывании НК с частицами с особой смарт-поверхностью. Это обеспечивает более эффективное связывание высокомолекулярной ДНК, а также уменьшение стресс-факторов за счет отсутствия этапов вортексирования и центрифугирования. Методика основана на выделении НК при помощи систем дозирования жидкостей. Для экстракции используют специальные наконечники с «умными» частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе лизированного образца в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.4).

Рис.4 Схема протокола выделения НК при помощи технологии SmartExtraction.

Так выглядит схема автоматической экстракции, но в портфолио Analytik Jena также присутствуют два набора для ручного выделения ДНК на магнитных частицах с такой «умной» поверхностью из крови и клеток и тканей.

При больших потоках образцов и для упрощения этапа экстракции НК можно использовать автоматические решения от Analytik Jena:

Предназначена для эффективной и воспроизводимой экстракции ДНК/РНК при помощи технологий выделения на магнитных частицах, а также SmartExtraction.	Полуавтоматическая компактная дозирующая система для раскапки 96- и 384-луночных планшетов. Можно адаптировать для выделения НК.	Автоматическая дозирующая станция с гибкой модульной системой, которую легко трансформировать под индивидуальные задачи.

Продукция для выделения НК от компании QIAGEN

В нашем портфолио есть широкий спектр наборов для выделения НК от компании QIAGEN, причем особенность этих реагентов заключается в том, что можно подобрать набор под очень узкоспециализированную задачу в зависимости от типа выделяемой НК и биологического материала.

Такие реагенты лучше всего подойдут пользователям с нестандартными задачами, например в каталоге QIAGEN есть наборы для выделения сцДНК, митохондриальной и космидной ДНК или микроРНК.

Также есть наборы для элюции образца в очень малых объемах, для работы с архивными и сложнолизируемыми образцами, для выделения на спин-колонках, магнитных частицах или ферментативной экстракции в одной пробирке.

Подробнее изучить наборы QIAGEN вы можете в каталоге на официальном сайте .

В портфолио QIAGEN есть и автоматические станции для выделения НК:

Аналог ручного колоночного выделения До 12 образцов одновременно Совместим более чем с 80 наборами для выделения НК	Технология сорбции на кремниевой мембране 24-96 образцов одновременно Совместим с 7 наборами для выделения НК	Технология сорбции на магнитных частицах 24 — 96 образцов одновременно Совместим с модулем для ПЦР Есть РУ

Продукция для выделения НК от компании MicroGEM

Новозеландская компания MicroGEM представляет уникальную технологию ферментативного температурно-зависимого выделения НК в одной пробирке. Она начинается со смешивания буфера и особых ферментов с биологическим образцом. При последующей инкубации при 75°C протеиназы разрушают клетки и высвобождают нуклеиновые кислоты. Дальнейшее нагревание до 95°C дезактивирует протеиназы, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

Рис.5 Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения НК.

Эта технология очень простая и быстрая, и здесь отсутствуют потери НК, что позволяет работать даже с небольшим количеством образца. Однако, от этой технологии стоит отказаться, если для вас важна чистота выделяемой НК.

Узнать больше о данной технологии вы можете в нашем обзоре.

Наша команда научной поддержки может помочь с подбором идеального набора для ваших задач, для этого необходимо заполнить форму:

Акции

Мероприятия Молекулярная диагностика — 2021

Новости
Новый прибор от компании 10x Genomics!

Источник