Этапы выделения чистых культур анаэробов
Анаэробы — микроорганизмы, активно размножающиеся в бескислородных условиях, без доступа воздуха.
Выделение чистых культур анаэробов имеет особенности, проводят в течение четырех дней.
Первый день: 1. Посев исследуемого материала на среду Китт-Тароцци или на среду RCM в пробирки. Среды предварительно должны быть выдержаны на кипящей водяной бане в течение 30 мин, для удаления кислорода.
Второй день: 1. Бактериоскопия выращенной культуры, если в мазках крупные палочки, исследования продолжают.
2. Посев культуры, выросшей на средах КиттТароцци или RCM по Цейсслеру на три чашки с кровяным, сахарным агаром (МПА с 5% крови и 1% глюкозы). Посев выполняют бактериологической петлей штрихами, ставят в анаэростат, откачивают воздух, потом в термостат. Можно сделать посев по Вейнбергу на три столбика с сахарным агаром, предварительно агар в столбиках выдерживают на кипящей водяной бане 30 мин, затем охлаждают до 37-40 0 С. Столбики после посева ставят в термостат.
Третий день: 1. Изучают характер роста, отмечают «типичные колонии».
2. Проводят бактериоскопию «типичных колоний», если морфологические свойства соответствуют предполагаемым микроорганизмам, исследования продолжают.
3. Посев «типичных колоний» на среду Китт-Тароцци или на среду RCM.
Четвертый день: 1. Бактериоскопия выросшей культуры, если в мазках одинаковые клетки – культура чистая, приступают к определению ее вида, идентификации. Идентификацию анаэробных микроорганизмов проводят по тем же свойствам, как и аэробных. Важное значение имеет результат биопробы.
Если для выделения анаэробов используют улучшенный клостридиальный бульон (RCM), то после посева добавляют стерильное парафиновое масло и пастеризуют 30 мин при 75 0 С на водяной бане. Инкубируют посевы не менее 7 дней при 30 0 . Если обнаруживают черное окрашивание, проводят идентификацию.
Вопросы для обсуждения
1. Коллоквиум №1 по разделу «Общая микробиология».
Вопросы коллоквиума 1
1. Систематика микроорганизмов.
2. Систематика грибов.
3. Характеристика грибов и микозов.
4. Этапы приготовления мазка.
5. Характеристика палочковидных.
6. Разновидности кокков.
7. Характеристика извитых.
8. Характеристика риккетсий.
9. Характеристика хламидий.
10. Характеристика микоплазм.
11. L –формы бактерий, прото-, сферопласты.
12. Характеристика актиномицетов.
13. Структура бактериальной клетки.
14. Сложные методы окрашивания.
15. Техника и сущность окраски по Граму.
16. Способы размножения микроорганизмов.
17. Проницаемость и транспорт питательных веществ в клетки микроорганизмов.
18. Химический состав бактериальной клетки.
19. Типы питания бактерий.
20. Токсины микроорганизмов.
22. Питательные среды.
22. Культивирование бактерий, определения: чистая культура, смешанная культура, штамм, клон.
23. Типы дыхания бактерий.
24. Спиртовое и молочнокислое брожения.
25. Пропионовокислое, маслянокислое и ацетонобутиловое брожения.
26. Культуральные свойства бактерий.
27. Фазы роста микроорганизмов.
28. Выделение чистых культур аэробов.
29. Методы идентификации.
30. Выделение чистых культур анаэробов.
31. Мутации у микроорганизмов. 32. Рекомбинации у микроорганизмов.
ТЕМА 5 Методы стерилизации. Химические противомикробные препараты. Методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП и фагам
Цель занятия. Коллоквиум по разделу «Общая микробиология». Разобрать методы стерилизации, познакомиться с оборудованием для стерилизации. Разобрать и познакомиться с образцами химических противомикробных препаратов.
Разобрать и освоить методы определения микроорганизмов к антибиотикам, их распределения по группам на основе химической структуры и клинического применения. Познакомиться с методами определения чувствительности возбудителей к фагам.
Оборудование и материалы. Оборудование и инструменты для стерилизации. Образцы химических противомикробных препаратов.
Образцы антибиотиков и бактериофагов. Посевы ДДМ готовые к учету, Посев по методу серийных разведений, готовый к учету, чашки со средой АГВ, стерильные пипетки, бульонная культура, диски с антибиотиками. Образцы бактериофагов, посевы по методу Отто, Фюрта, Аппельмана, Грация готовые к учету
Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Познакомиться с оборудованием для стерилизации. 2. Познакомиться с химическими противомикробными препаратами и распределить представленные в таблице образцы по группам назначения. 3.Освоить постановку и учета метода ДДМ, распределить образцы антибиотикам по группам на основе химической структуры и клинического применения.2. Познакомиться с образцами фагов и методами определения чувствительности возбудителей к бактериофагам.
Таблица 4 — Распределение препаратов по группам назначения
Источник
Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов
Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при помощи физических, химических и биологических методов.
1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.
2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат. В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.
3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из герметически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью.
1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде
2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства.
3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин.
4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.
Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку герметично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы.
Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов
Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:
Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.
Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.
Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.
Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6×6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.
Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.
Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Ферменты бактерий.
2. Методы изучения ферментативной активности микроорганизмов.
3. Дыхание бактерий.
4. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.
Литература для подготовки к занятию:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
3. Медицинская микробиология. Справочник. Под ред. В.И. Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД, 1998.
Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.
Источник
Методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
I. Методы механического разобщения бактерий.
1. Посев материала на чашки Петри бактериальной петлёй, шпателем, пипеткой, последовательно на несколько сред, не прокаливая инструмент (по Дригальскому). При таком посеве материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесённым в конце посева, вырастают изолированные колонии бактерий.
2. Посев пластинчатыми разводками (метод рассева в глубине среды по Коху) применяют, если в исследуемом материале содержится много бактерий. Готовят десятикратные разведения материала в пробирках, затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, перемешивают, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.
3. Разобщение на основе подвижности бактерий. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные бактрии как бы «мигрируют» вверх по агаровому скосу и вырастают в виде колоний, расположенных в верхней части скошенного агара. При 2–3-кратном пассировании этих колоний в конденсационную жидкость скошенного агара удается получить чистую культуру подвижной бактерии (например, протея).
4. Разобщение на основе размеров микроорганизмов используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм. Для этого смесь микроорганизмов фильтруют через микро- и миллипористые фильтры. Чистые культуры микроорганизмов получают в фильтрах.
II. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический) основан на избирательной чувствительности животных к микроорганизмам различных видов. Это выражается в быстрой скорости размножения определенного вида микроорганизмов при попадании в кровь и внутренние органы животного, откуда их затем выделяют. При этом другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма животного. Так выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, чистую культуру палочки туляремии из организма морской свинки.
III. Методы, основанные на избирательной чувствительности микроорганизмов к воздействию внешних факторов (предварительно или во время культивирования):
а) физических факторов:
— высокой температуры: спорообразующие бактерии родов Clostridium и Bacillus выживают при нагревании смеси микробов, а неспорообразующие — гибнут;
— низкой температуры: при пониженных температурах культивируют Y. enterocolitica, Y. pestis, L. monocytogenes;
б) химических факторов:
— кислот: при обработке кислотой смесей кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий, последние гибнут, а кислотоустойчивые (возбудители туберкулёза) остаются в чистой культуре; использование среды Сабуро (рН 5-6) для выделения грибов;
— щелочей: использование щелочной пептонной воды для выделения V. cholerae; использование метода гомогенизации мокроты с 10% NaOH при выделении M. tuberculosis;
— солей: на элективных средах растут определённые виды бактерий (например, стафилококк растёт на ЖСА, содержащем 10–15% NaCl);
— антибиотиков: основан на избирательной чувствительности определённых видов бактерий к отдельным антибиотикам. При посеве смеси бактерий на среду с добавлением антибиотика, вырастают нечувствительные к нему бактерии: выделение микоплазм на средах с пенициллином, выделение анаэробов на средах с аминогликозидами.
— красителей: красители добавляют к питательным средам для подавления роста сопутствующей флоры: при выделении энтеробактерий в среду Левина добавляют метиленовый синий и эозин для подавления грамположительных бактерий, при выделении микобактерий в среду Левенштейна-Йенсена добавляют малахитовый зелёный.
— специфических ингибиторов: среда с теллуритом калия используется для выделения C. diphtheriae, среда с селенитом натрия используется для выделения Salmonella, среды с желчью используются для выделения энтеробактерий и бактероидов.
Источник
