Способы уплотнения заливки гистология

При отсутствии специального стола с успехом может быть приспособлен любой стол (желательно с ящиками) с площадью рабочей поверхности не менее 60*120 см.

Если крышка стола не имеет специального покрытия, то его следует сделать из какого либо влагоустойчивого материала. Однако участок стола, предназначенный для непосредственной работы по приготовлению препаратов, в любом случае необходимо накрыть стеклом и расположить под ним небольшие (9*12см) листы белой или черной бумаги. Этим создается соответствующий фон, облегчающий работу с окрашенными (белый лист) и не окрашенными (черный лист) объектами. Рекомендуется также на оба листа нанести контуры предметного стекла с обозначением места расположения и размеров покровного стекла. Это простой прием позволяет рационально разместить на предметном стекле срезы в процессе из заключения.

Для того, чтобы удобнее расположить необходимое оборудование, следует иметь двухъярусную полку для реактивов, растворов и посуды, которая устанавливается либо перед работающим (вдоль заднего края стола), либо сбоку в зависимости от расположения стола относительно источника света.

В настоящем разделе дается описание лишь самых необходимых образцов.

ШИРОКОГОРЛЫЕ БАНКИ С ПРИТЕРТЫМИ ПРОБКАМИ различной вместимости от 50 до 200 мл– используют для составления гистологических батарей, предназначенных для подготовки кусочков тканей к заливке различными средами. Более крупные банки применяют для фиксации и хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, обработки предметных стекол, приготовления нейтрального формалина и пр.

Вместо банок с притертыми пробками можно использовать небольшие хозяйственные банки с жестяными завинчивающимися крышками разного объема.

БЮКСЫ—небольшие круглые стеклянные стаканчики различного диаметра и высоты с шлифованными крышками

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СТАКАНЧИКИ—круглые , овальные или четырехугольные ( как и высокие бюксы) применяют для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах. Для придания устойчивости и обеспечения порядка в расстановке их помещают в специальные стойки, изготовленные из дерева или пластмассы, по несколько штук в ряд в зависимости от методики обработки.

ЧАШКИ ПЕТРИ—широкие, плоские стеклянные чашки с крышками– пригодны для различных манипуляций ( окраска свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов, использование в качестве подставок под бюксы и т.д.).

МЕРНАЯ ПОСУДА– цилиндры и мензурки различной емкости (от 10 до 250-500 мл) воронки различных размеров.

ХИМИЧЕСКИЕ СТАКАНЧИКИ—круглые стеклянные стаканчики без крышек вместимостью 50-100 мл– находят широкое применение при проведение гистохимических реакций, окраски срезов наклеенных на стекла и т.д.

КОЛБЫ (плоскодонные) вместимостью от 50 мл до 2 л. Малые колбы применяют для приготовления и хранения растворов различных красителей, большие—под дистиллированную воду и прочие жидкости, расходуемые в больших количествах.

ПИПЕТКИ обычные (предназначенные для закапывания лекарств) используют для накапывания на срезы красителей и различных жидкостей, градуированные (вместимостью 0,1-100 мл) применяют для отмеривания малых количеств различных жидкостей. Можно использовать в настоящее время широко используемые автоматические пипетки различной вместительности.

ПРЕДМЕТНЫЕ СТЕКЛА — прямоугольные пластины размером 76*25 мм толщиной 1 мм предназначенные для размещения гистологических срезов в процессе приготовления постоянных препаратов.

ПОКРОВНЫЕ СТЕКЛА представляют собой тонкие (0,15-0,2 мм толщины) пластинки различных размеров. Служат для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметных стеклах. Размеры покровных стекол выбирают в зависимости от площади объекта.

Инструменты, используемые в гистологической лаборатории, включает пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажимы, корнцанг, шпатели, препаровальные иглы– прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необходимы при импрегнации серебром, когда металлические иглами пользоваться нельзя,

Так же необходимо иметь спиртовку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу.

ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Взятие материала, его фиксация и уплотнение.

Умерщвление экспериментальных животных

В лабораторной практике применяют ряд методов умерщвления экспериментальных животных: отсечение головы (декапитация), умерщвление при помощи наркоза, пропускание электрического тока через тело животного, введение в кровеносное русло воздуха (укол в сердце или внутривенно) или в плевральную полость эфира(хлороформа)

Выбор метода диктуется видом животного и целями исследованиями, но наибольшее распространение в лабораторной практике получили два первых способа умерщвления.

Отсечение головы (декапитация) является основным способом умерщвления мелких лабораторных животных (лягушки, мыши, крысы) и осуществляется с помощью ножниц.

Материалом для гистологического исследования могут служить кусочки органов экспериментальных животных. Полученный путем прижизненного иссечения у человека кусочков тканей( биопсия), трупный материал, мазки жидких исследуемых материалов (крови, костного мозга).

После умерщвления тело животного быстро фиксируют в положении на спине. Лягушек, тритонов, мышей и других мелких лабораторных животных фиксируют на дощечках, восковых или пробковых пластинках, прикалывая за растянутые в стороны лапки. Для фиксации средних и крупных лабораторных животных используют специальные станки или же изготовленные для этих целей доски (оцинкованные или окрашенные с вбитыми по краям крючками или гвоздиками для привязывания конечностей)

Техника вскрытия брюшной и грудной полостей для всех лабораторных животных одинакова. Однако у животных имеющих шерстный покров, вначале следует иссечь достаточно широкий кожный лоскут, чтобы избежать загрязнение внутренних органов. Для этого, захватив и приподняв ( с помощью хирургического пинцета) кожу нижней части стенки живота по средней линии, подрезают ножницами образовавшуюся складку по направлению к голове, срезая кожный лоскут на нужном протяжении.

Затем следует сменить ножницы (или очистить их от прилипшей шерсти) и удалить влажным тампоном шерсть, попавшую на образовавшуюся «дорожку».

ВСКРЫТИЕ БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ.

Нижнюю часть стенки живота приподнимают пинцетом по средней линии ( что бы не повредить органы), прорезают ножницами вход в брюшную полость, ввода туда одну из браншей( но обязательно тупую) и разрезают стенку кверху до грудины. Затем берут кровоостанавливающие зажимы, захватывают ими внутренние слои стенки живота вместе с брюшной и отворачивают кнаружи, раскрывая брюшную полость.

ВСКРЫТИЕ ГРУДНОЙ ПОЛОСТИ

Вскрытие производиться двумя разрезами через реберные хрящи по обе стороны от грудины снизу вверх. Образовавшийся костно-хрящевой лоскут удаляют.

У мелких лабораторных животных следует вскрыть одномоментно брюшную и грудную полости для обеспечения достаточно свободного доступа к внутренним органам, у крупных же вскрывать только ту полость, откуда необходимо брать органы для исследования.

Главным требованием при взятии материала являются: максимальное сокращение сроков взятия, минимальное травмирование тканей, создание оптимальных условий для фиксации.

Первое и второе требование обеспечивается хорошим освоением техники умерщвления и вскрытия, а также применением очень острых режущих инструментов (скальпель, бритва, ножницы).

При иссечении материала необходимо максимально бережно обращаться с тканями: участки органов, подвергшихся травмированию (например, при зажиме пинцетом) не следует оставлять для исследования.

Благоприятные условия для фиксации создаются правильным выбором размера фиксируемого материала, ибо необходимо обеспечить равномерное и сравнительно быстрое проникновение фиксирующей жидкости во всю его толщину. Поэтому нужно вырезать кусочки толщиной не более 5-10 мм. Поперечные же и продольные размеры не имеют столь важного значение и определяются задачами исследования.

Вырезание кусочков для фиксации является одним из ответственных этапов в приготовлении качественных микропрепаратов и исследовательской практике и, как правило, должно производиться самим исследователем.

Если орган состоит из участков, различных по своему строению, необходимо проводить разрез таким образом, что бы все они попали в кусочек, а при не возможности — брать кусочки отдельно из каждого участка. Например, при взятии кусочков мозга человека или крупных лабораторных животных приходиться вырезать участки из определенных отделов. Из почки можно вырезать один кусочек, охватывающий всю толщину органа от капсулы до лоханки, что обеспечивает попадание в него всех слоев. Если орган имеет однородное строение (большинство желез, мышцы), то выбор места для вырезания кусочка не имеет большого значения.

Если необходимо приготовить гистологические препараты из стенки кишечника, иссекают нужный отрезок органа, ополаскивают его в изотоническом растворе хлорида натрия (что бы не высохла серозная оболочка), разрезают вдоль (напротив брыжейки) и накалывают с помощью игл на восковую или пробковую подушку в расправленном состоянии слизистой оболочкой кверху.

Взятие материала из легкого также имеет некоторые особенности, ибо легкое всегда содержит воздух и ткань его плавает, не погружаясь полностью в фиксирующую жидкость. Для полного погружения необходимо кусочек органа завернуть в марлю в месте с каким-либо грузом.

Задачи и правила фиксации

Цель фиксации — убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и, по возможности, сохранить ее прижизненное строение.

Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки.

Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый материал. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. В среднем для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5-10 мм.

Различают фиксирующие средства (простые фиксаторы)и фиксирующие смеси (сложные фиксаторы)

Формалин является самым дешевым и распространенным фиксатором. В чистом виде представляет, светлую, сильно пахнущую жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. Применяют преимущественно в виде 10% водного раствора, для чего часть формалина (т. е. 40% раствора формальдегида) разводят 9 частями воды. Приготавливают раствор обязательно на водопроводной воде, так как дистиллированная вызывает набухание тканей.

Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств:

а) высокой степени диффузии;

б) способности хороню сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта;

в) оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала;

г) хорошо сохранять жиры и липоиды.

Высокая диффузионная способность и незначительное осаждающее действие позволяют формалину довольно быстро и глубоко проникать в ткани, что позволяет фиксировать кусочки органа размером от 1 см и более, а при необходимости и довольно крупные органы целиком.

Срок фиксации тканей в формалине 24—48ч. Обычный формалин, как правило, содержит примесь метилового спирта и муравьиной кислоты, количество которой увеличивается под влиянием света.

При охлаждении формалина в растворе появляется муть, оседающая в виде белого осадка (параформальдегид). Такой же осадок наблюдается на стенках сосуда и при испарении формалина. Поэтому формалин следует хранить в темной плотно закрывающейся стеклянной посуде при температуре не ниже 9°С.

Нейтрализация формалина. Примесь в формалине муравьиной кислоты придает раствору слабокислый характер, что нежелательно при применении ряда методов исследования (некоторые гистохимические реакции, серебрение раствором нитрата серебра). Способ нейтрализации формалина довольно прост: в сосуд засыпают карбонат кальция (или карбонат магния) в таком количестве, чтобы на дне образовался слой толщиной 1,5—2 см. Затем наливают формалин, несколько раз энергично встряхивают и оставляют стоять 24—48 ч. В течение этого времени происходит нейтрализация раствора.

Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе формалина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранить этот недостаток можно путем помещения материала на 2 недели в 1% раствор нитрата серебра или 10% раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10% растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации. При фиксации формалином в препаратах нередко появляется темно-коричневый кристаллический осадок — результат взаимодействия формалина с находящимся в тканях гемоглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1—5% раствор аммиака или 70% этиловый алкоголь на различные сроки (от 5 мин до 4 ч). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку.

Следует постоянно помнить, что длительное действие паров формалина сильно раздражает слизистые оболочки. Смачивание кожи формалином оказывает дубящий эффект, а при повторных частых контактах вызывает сухую экзему. Поэтому перед препарированием формалиновые препараты помещают в слабо аммиачную воду (для устранения запаха) и работают в резиновых перчатках (при возможности под вытяжным устройством).

Этиловый спирт. фиксирующее действие осуществляется за счет отнятия у тканей воды и коагуляции белков. Несмотря на ряд отрицательных свойств спирта (сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворение и экстракция жиров и гемоглобина), он как фиксатор находит широкое применение в микроскопической технике. Это объясняется тем, что этиловый спирт осуществляет быструю фиксацию, не требующую обезвоживания тканей перед заливкой в парафин и целлоидин. Будучи химически неактивным веществом, спирт особенно пригоден при гистохимических исследованиях. В нем хорошо сохраняются такие вещества, как муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций, которые легко растворимьи в других фиксирующих жидкостях. Чаще применяют 96% и абсолютный этиловый спирт. Некоторые авторы рекомендуют также концентрации 80 и 90%. Время фиксации зависит от материала: для тонких пленок — 15—30 мин, для кусочков толщиной 3—4 мм — 2—4 ч. В связи с тем что спирт легче воды, она, экстрагируясь из тканей, опускается на дно. Поэтому под кусочки исследуемого материала нужно обязательно подкладывать толстый слой ваты. Излишнее пребывание препарата в спирте вызывает чрезмерное уплотнение ткани, что плохо отражается на последующей ее обработке. Для приготовления абсолютного спирта 96% спирт наливают на прокаленный сульфат меди, лишенный кристаллизационной воды и имеющий вид серовато-белого порошка. Отнимая воду от спирта, он приобретает синий цвет. Обезвоживание лучше проводить последовательно в двух или трех сосудах. При этом в последнем сосуде медь остается почти безводной и абсолютный спирт над ней может храниться долго.

Время фиксации в этиловом спирте -12-24 ч, при этом фиксатор нужно З раза сменить. Преимущества метода: быстрота, пригодность почти для всех методов окрашивания, хорошая сохранность водорастворимых элементов (гликоген, мочевая кислота).

3. АЦЕТОН. В последнее время все большее применение в гистологических лабораториях для гистохимических целей находит фиксация ацетоном благодаря простоте, возможности быстрой фиксации и сохранению после нее многих химических соединений, в том числе активности многих ферментов. Недостаток метода — нарушение тонкой цитологической структуры. Применять следует бесцветный (безводный) раствор. Фиксировать можно как кусочки тканей так и срезы. Приготовленные в криостате срезы расправляют кисточкой на предметном стекле, переносят в плотно закрытый стаканчик с холодным (5—10%) ацетоном и помещают в баню с сухим льдом или же в камеру криостата. Срок фиксации зависит от толщниы срезов (в среднем 5—10 мин можно хранить и несколько дней).

В настоящее время применение ее в чистом виде ограничено. Однако она служит исходным раствором для приготовления таких распространенных фиксаторов, как жидкости Ценкера, Орта, Максимова и др.

Бихромат калия 2,5 г

Сульфат натрия 1,0 г.

Вода дистиллированная 100 мл.

Для лучшего растворения бихромата калия рекомендуется подогревать воду.

Фиксация по Навашину—Крылову.

Фиксация этим методом дает хорошие результаты при окраске ядер и протоплазматических структур железным гематоксилином.

Состав фиксатора Навашина:

Хромовой кислоты 1% р-р. 10 мл

Формалин 10% р-р. -10 мл

Вода дистиллированная -90 мл.

Уксусная кислота ледяная -2 мл (добавляют непосредственно перед фиксацией)

Кусочки толщиной 5 мм следует фиксировать 4—6 ч; затем тщательно промыть в проточной воде (24—36 ч) для удаления хромовой кислоты, остатки которой ухудшают окраску препаратов. Г. И. Крылов предложил перед промывкой проводить кусочки через несколько порций 5—10% формалина до прекращения желтого окрашивания раствора (формалин извлекает хромовую кислоту из тканей). Эта процедура сокращает сроки промывания в воде.

(формалин, спирт, уксусная кислота) Бродского.

Рекомендуется для изучения структуры тканей и количественного цитохимического анализа нуклеиновых кислот. Преимущество ФСУ перед фиксатором Карнуа в том, что формалин подавляет активность ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты (нуклеазы) в фиксируемых клетках, благодаря чему количественно лучше сохраняются ДНК и РНК.

Состав и способ употребления:

Формалин нейтральный разведенный -3 части

Спирт этиловый 96° -1 чась

Уксусная кислота ледяная -0,3 части

Кусочки тканей 2 х 2 или 2 х 3 мм; время обработки 1—4ч в зависимости от свойств объекта.

После фиксации кусочки промыть водой в течение 12 ч или (для цитохимических целей) в течение того же времени тремя сменами 70% спирта. Быстро обезводить и залить в парафин.

Рекомендуется как лучший фиксатор для гистохвмического выявления гликогена (особенно, где его мало, — центральная нервная система).

Первый раствор- Спирт этиловый 96%-100 мл., Нитрат меди-1,8 г., Нитрат кальция-0,9г., Формалин нейтральный-10 мл.

Второй раствор — Спирт этиловый 96%-100 мл., Нитрат кадмия-2,6 г., Формалин нейтральный -10 мл.

Кусочки органа (не более З х З мм) фиксировать З ч в первом растворе, затем перенести во второй раствор на З ч. Промыть в трех-четырех сменах 70% спирта по 2 ч. Залить в парафин или целлоидин.

ПРОМЫВАНИЕ, ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ЗАЛИВКА ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Успешная фиксация исследуемого объекта — лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, срезался тонкими ровными слоями. для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить какой-нибудь уплотняющей средой.

Цель этой процедуры — освободить исследуемый объект от излишнего количества фиксатора. Способ промывания зависит от методики фиксации. Например, после фиксирующих смесей, содержащих пикриновую кислоту, дихлорид ртути, трихлоруксусную кислоту, применяют этиловый спирт разной концентрации. После фиксации в формалине, в жидкостях, содержащих хром, осмиевую кислоту, обычно употребляют воду. В большинстве случаев промывку кусочков тканей производят в проточной водопроводной воде. Наиболее удобно это делать, помещая объект в стеклянные или фарфоровые сита, которые закрывают пробкой и опускают в сосуд с проточной водой. Пробка обеспечивает плавучесть, а отверстия — постоянную циркуляцию воды. Если кусочек не прошит ниткой, то этикетку также помещают в сито. При отсутствии сита кусочек заворачивают в марлю и подвешивают за нитку в сосуд, наполненный водой. Верх сосуда закрывают марлей и проделывают в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран натягивают резиновый шланг или привязывают шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускают через марлю в сосуд и пускают по нему несильную струю воды. Среднее время промывание 20—24 ч.

Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации. Для проведения процедуры приготавливают необходимое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками,(можно использовать не большие банки с завинчивающейся крышкой ) этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи.

Спирты нужной крепости приготавливают заранее по специальной таблице разведения из 96 или 95 % этилового спирта

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СПИРТОВ

Источник

Вам также может понравиться

Ясень семена способ распространения

Ясень обыкновенный Fraxinus excelsior – так в ботанической

Ярлыки способы создания ярлыков ос windows

Создаем ярлыки на рабочем столе Windows Создаем ярлыки

Японское удобрение фуджима способ применения

Удобрения Фуджима Знаете потрясающее удобрение, палочка

Японский чай способ заварки

Технология заваривания японского чая Известно, что