Способы слияния изолированных протопластов

РЕФЕРАТ
Способы и механизмы слияния изолированных протопластов

разных видов растений

Содержание
Введение 3

1. Физический способ слияния протопластов 4
2. Химический способ слияния протопластов 5
3. Реципрокные цибриды табака и красавки 8
4. Обратный перенос хлоропластов как доказательство

аллоплазматической несовместимости 10

Список используемой литературы 13

Введение

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Изолированный протопласт – это содержимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлюлозная стенка у данного образования отсутствует. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение – регенерант.

Протопласты являются уникальной моделью для изучения фундаментальных физиологических процессов у растений. Они незаменимы при изучении состава, структуры и функционирования плазмалеммы в норме и при воздействии на нее гормонами, ингибиторами, фитототоксинами, а также при взаимодействии самих протопластов в популяции.

Изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточной стенки, 36 могут сливаться между собой. Слияние протопластов – это метод гибридизации, который называется соматической гибридизацией. В отличие от обычной, где сливаются половые клетки (гаметы), при соматической гибридизации половая совместимость клеток исходных растений не имеет существенного значения. Техника соматической гибридизации обеспечивает:

1. Объединение геномов клеток разных видов и родов, которое протекает только в искусственных условиях;
2. Получение асимметричных гибридов, несущих генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами, органеллами или цитоплазмой другого;
3. Слияние трех и более клеток;
4. Получение гибридов, представляющих сумму генотипов родителей;
5. Перевод мутаций в гетерозиготное состояние, что позволяет получать жизнеспособные формы при слиянии протопластов, поскольку мутагенез довольно часто дает дефектное по морфогенезу растение;

1. Физический способ слияния протопластов

Чаще всего протопласты изолируют из листьев, затем из конусов нарастания, корней, корневых клубеньков бобовых и микроспор. Приблизительно у 50 видов довольно успешно проведено изолирование протопластов, из которых регенерированы целые растения. Наиболее результативно процесс удалось осуществить у представителей родов Brassica, Nicotiana, Petunia и Solanum.

Слияние бывает спонтанным (чаще у протопластов из молодых тканей или суспензионных культур) и индуцированным. Для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов, как физических, так и химических.

При физическом способе слияния протопластов, разработанном Г. Циммерманом с сотрудниками в 1981 году, протопласты помещают в камеру с неоднородным электрополем. На электродах образуются агрегаты из 2 — 3 протопластов, либо цепочки из 5 — 6 протопластов между электродами. Дополнительный единичный импульс постоянного тока приводит к образованию пор в сильно сжатых мембранах, происходит перетекание цитоплазмы, так как переменный ток удерживает протопласты вместе некоторое время, и протопласты в таких агрегатах сливаются. Затухающий ток приводит к возвращению сферической формы у слившихся протопластов.

В основе слияния лежит различное действие постоянного и переменного электрического тока на плазмалемму. Постоянное эклектическое поле сжимает мембраны, ведя к их локальному разрушению, а переменное электрополе вызывает латеральную диффузию белков мембраны, образуя свободные от гликопротеидов липидные области, где противоположные мембраны могут установить контакт.
2. Химический способ слияния протопластов

Чаще для индукции слияния протопластов используют методику «ПЭГ — высокие значения рН — высокая концентрация Са2+», которая дает до 50% слившихся протопластов (рН 9 — 11, концентрация Са2+ 100 — 300 ммоль/л). В присутствии полиэтиленгликоля наблюдается сильная адгезия протопластов, после удаления полиэтиленгликоля и добавления кальция — их слияние. Предполагают, что рН и ионы кальция увеличивают текучесть мембран, что связано с их жидкостно-мозаичной структурой.

При слиянии протопластов различных растений, например, А и В, могут с равной вероятностью образовываться комбинации АА, ВВ и АВ. Желаемый продукт слияния — АВ, поэтому разрабатываются способы увеличения частоты слияния именно такого типа и избирательного выделения только продукта слияния АВ. Один из таких методов заключается в следующем. Поверхность протопласта обычно несет отрицательный заряд. Путем обработки ее фосфолипидом, несущим положительный заряд, можно временно придать поверхности протопласта положительный заряд. Если теперь протопласты А, имеющие положительный заряд, смешать с необработанными протопластами В, несущими отрицательный заряд, то будут в основном образовываться комбинации АВ в результате притяжения разноименных зарядов.

Разработаны также методы маркирования протопластов того или иного растения с помощью разных флуоресцентных красителей. Если обработать протопласты одного растения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), а протопласты другого растения родаминизотиоцианатом (RITC), то можно, не изменяя активности клеток, пометить их желто-зеленой (FITC) или красной (RITC) флуоресценцией. Гибриды, образовавшиеся путем слияния разных типов клеток, будут иметь оба цвета флюоресценции — желто-зеленый и красный.

Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния, как правило, разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году (Карлсон и коллеги), в нашей стране подобное осуществили в лаборатории Бутенко Р.Г. в 1975 году.

Судьба геномов (ядерного и цитоплазматического) после слияния протопластов может быть различной:

1.Ядерные генетические детерминанты наследуются как дву-, так и однородительски. В последнем случае ядра не сливаются и впоследствии сегрегируют в процессе клеточных делений;

2.В неядерные генетические детерминанты наследуются двуродительски. При этом в межвидовых комбинациях прослеживается тенденция к соматическому выщеплению и элиминации одного из родительских цитоплазматических геномов;

3.Возникновение гибридных клеток и растений в результате слияния более чем двух родительских клеток.

Таким образом, слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид — продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид (цито­плаз­матический гибрид) — растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. Цибриды получают, облучая перед слиянием один из протопластов γ-лучами для разрушения ядра. Скрининг таких клеток проводится по генам – маркерам ядерного и цитоплазматических (митохондриального и хлоропластного) геномов. Есть указания на рекомбинацию ДНК митохондрий и хлоропластов в гибридных клетках (Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник, 1984).

При слиянии могут образовываться и так называемые асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы.

Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты.

Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням.

Функциональные цибриды табака Nicotiana tabacum(+Atropa belladonna). В двух независимых экспериментах по слиянию мезофильных протопластов пластомного хлорофиллдефектного мутанта DSR N. tabacum (2n = 48) и дикого типа A. belladonna (2n = 72) была отобрана 41 зеленая каллусная линия. Поскольку для культивирования протопластов использовали селективную питательную среду, на которой клетки красавки не были способны к делению, практически все зеленые колонии (за исключением четырех выживших линий A. belladonna) оказались гибридными. После анализа генетической конституции ядерного генома (числа и размера хромосом, морфологии и спектров амилазы, эстеразы и пероксидазы) и пластома (рестрикционных BamHI, HindIII и PstI) регенерантов, полученных из 37 оставшихся клеточных линий, были идентифицированы как ядерные и цитоплазматические гибриды (4 и 33 линии, соответственно). Межгибридные цибриды, унаследовавшие ядро табака и хлоропласты красавки, были зелеными, иногда пестролистными, функциональными растениями, морфологически идентичными N. tabacum. Они хорошо росли в почве, цвели и завязывали жизнеспособные семена как после самоопыления, так и при опылении пыльцой табака. Среди потомства пестролистных цибридов, полученного после самоопыления, некоторые растения также были пестролистными. При электронно-микроскопическом анализе тканей, изолированных из пестролистных участков листьев, обнаружено присутствие гетеропластидных клеток, которые содержали как дифференцированные, так и в значительной степени недоразвитые хлоропласты. Дифференцированные пластиды также имели некоторые аномалии: большинство хлоропластов содержали сетчатые участки. К тому же анализ тилакоидных протеинов хлоропластов выявил у всех цибридных линий в значительной степени редуцированное количество полипептида 27kDa, который, судя по молекулярной массе и относительному содержанию, вероятно, соответствовал хлорофиллa/bсвязывающему протеину светособирающего комплекса II (ССК II). Кушнир не рассматривали функциональность цибридов Nicotiana (+Atropa) как результат ядерно-хлоропластной совместимости. Учитывая проявление пестролистности, аномалии в развитии хлоропластов и низкое содержание одного из мажорных тилакоидных полипептидов, они указывали лишь на отсутствие безупречной кооперации между ядерным геномом табака и пластомом красавки. Позднее Бабийчук и другие уже специально изучали хлорофиллa/bсвязывающие протеины ССК II не только у растений N. tabacum (+A. belladonna), но и у других цибридов табака с хлоропластами Nolana paradoxa, Physochlaine officinalis, Lycium barbarum или Scopolia carniolica, а также у цибрида N. plumbaginifolia с пластидами красавки. У растений всех аллоплазматических комбинаций обнаружили деградацию и или ненормальный процессинг этих полипептидов по сравнению с родительскими видами как возможный ответ на присутствие чужеродных пластомов. У цибридов хлорофиллa/bсвязывающие протеины становились короче на 11–12 аминокислот, что, по мнению авторов, могло быть связано с несовместимостью генетических компартментов. Известны также два случая, когда пестролистность цибридов связывали с мутациями хондриома, а не пластома. Пестролистность и угнетенный рост наблюдали у восьми линий цибридов культурного томата L. esculentum(+ L. pennellii), содержащих пластиды L. esculentum и гибридные митоходрии , и у одной линии цибрида табака N. tabacum(+ Petunia hybrida), имеющей пластом P. hybrida и рекомбинантный хондриом . В первом случае Bonnema et al., называя цибриды с ненормальным фенотипом мутантами, все же обсуждают возможность появления таких изменений вследствие несовместимости между рекомбинантным хондриомом и ядерным геномом или пластомом культурного томата, очевидно, имея в виду низкую вероятность одновременного возникновения одинаковых мутаций в восьми линиях цибридов. Во втором случае Bonnett et al. , учитывая происхождение единственного мутантного цибрида (выщепление из побега с нормальным фенотипом) среди 70 полученных цибридных линий табака с хлоропластами петунии, даже не рассматривают феномен ядерно-цитоплазматической несовместимости.

4.Обратный перенос хлоропластов как доказательство аллоплазматической несовместимости.

Обратный перенос хлоропластов выполняли по стандартной методике донорреципиентного слияния протопластов. В данном случае гибридизировали мезофильные протопласты пластомного хлорофиллдефектного мутантареципиента Lp3alb L. peruvianum var. dentatum линии 3767 и γоблученного цибридадонора L. esculentum(+ L. peruvianum var. denta6 tum) клона 1С. Более 20 клонов с диплоидным кариотипом 2n=2x=24 были найдены среди зеленых растенийрегенерантов, полученных в трех независимых экспериментах. Анализ морфологии и ММФЭ эстеразы и пероксидазы показал, что все диплоидные регенеранты обладают ядром L. peruvianum var. dentatum и полностью функциональны. В свою очередь, электрофорез рестрикционных фрагментов ДНК выявил, что все клоны унаследовали пластом L. peruvianum var. dentatum, и таким образом, подтвердил обратный перенос хлоропластов цибрида L. esculentum(+ L. peruvianum var. dentatum) на исходный ядерный фон перуанского томата. Полученные цибридные растения L. peruvianum var. dentatum(+ L. esculentum(+ L. peruvianum var. dentatum) полностью восстанавливали темно-зеленую окраску листьев, полноценное развитие, мужскую фертильность, самонесовместимость и способность расти в открытом грунте. К тому же у них отсутствовал признак карликовости, но отмечалось незначительное отставание в росте и крайне редкое засыхание отдельных побегов. Все клоны цибридных растений перуанского томата с обратно перенесенными хлоропластами также полностью восстанавливали фотосинтетическую активность. В частности, у них не было обнаружено снижения фотохимической активности ФС II, существенных изменений активности фотосинтетического аппарата или уменьшения содержания пигментпротеиновых комплексов ФС I . Наряду с восстановлением нормального фенотипа эти данные также подтверждали способность пластид L. peruvianum var. dentatum и их генетического аппарата нормально развиваться и функционировать, если путем соответствующего слияния протопластов им обеспечивали совместимый ядерный фон.

Источник

Вам также может понравиться

Ясень семена способ распространения

Ясень обыкновенный Fraxinus excelsior – так в ботанической

Ярлыки способы создания ярлыков ос windows

Создаем ярлыки на рабочем столе Windows Создаем ярлыки

Японское удобрение фуджима способ применения

Удобрения Фуджима Знаете потрясающее удобрение, палочка

Японский чай способ заварки

Технология заваривания японского чая Известно, что