Способы приготовления препаратов микроорганизмов

1. Приготовление препаратов микроорганизмов

Для просмотра микроорганизмов в оптических микроскопах готовят препараты живых и фиксированных (убитых) клеток.

1.1. Приготовление препаратов живых клеток

Препарат «раздавленная капля» используют для определения формы клеток микроорганизмов, их размеров и взаимного расположения, способа спорообразования, наличия или отсутствия подвижности.

На сухое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, добавляют к ней небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов или другой исследуемый материал (сенной настой и др.), размешивают, покрывают покровным стеклом. Если исследуют негустые суспензии микробных клеток, то каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля с исследуемым материалом должна быть такой, чтобы после прижимания ее покровным стеклом жидкость не выступала из-под стекла. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.

Препарат «висячая капля» используют для наблюдения за размножением микроорганизмов, образованием и прорастанием спор, для выявления подвижности и отношения клеток к химическим раздражителям.

Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки (рис. 1.1).

Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что позволяет вести многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде.

Препарат «отпечаток» используют для изучения естественного расположения клеток в колонии микроорганизмов и чаще всего для исследования формы спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов.

Из агаризованной среды, на которой исследуемые микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или к колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и сразу же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом.

Источник

ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I — Л. В. Красникова — 2016

3. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: получить представление о работе с чистыми культурами микроорганизмов; научиться готовить фиксированные окрашенные и прижизненные препараты микроорганизмов и препараты-отпечатки.

В практике микробиологии морфологию, биохимию и физиологию микроорганизмов изучают, используя чистые культуры микроорганизмов. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, являющихся потомством одной клетки.

При работе с чистыми культурами следует соблюдать определенные условия, которые позволили бы предохранить их от загрязнения другими микроорганизмами. Все операции проводят в зоне горящей спиртовки. Мелкие предметы (предметные стекла, пинцеты, ножницы, бактериологические петли и иглы) стерилизуют — фламбируют (от нем. flamme — пламя) в пламени спиртовки. Микроорганизмы, выращенные на плотной среде, извлекают из пробирки с помощью бактериологической петли или иглы. Для взятия бульонной культуры используют стерильную пипетку или петлю.

3.1. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов

Цель фиксации: убить клетки микроорганизмов и зафиксировать их на поверхности предметного стекла, чтобы они не были смыты при окрашивании и промывке водой; улучшить окраску клеток, поскольку мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей.

Порядок приготовления фиксированного окрашенного препарата при взятии культуры микроорганизмов, выращенных в пробирке на скошенном питательном агаре, следующий:

1. Зажечь спиртовку.

2. Взять чистое предметное стекло и профламбировать его, пронеся несколько раз сквозь пламя спиртовки.

3. Охладить стекло на столе и нанести на него каплю воды из флакона.

4. Взять пробирку с культурой в левую руку между большим и указательным пальцами и держать в наклонном положении так, чтобы было видно содержимое пробирки.

5. Взять в правую руку бактериологическую петлю, накалить докрасна проволоку в пламени спиртовки и обжечь примыкающую к проволоке часть держателя.

6. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать к ладони ватную пробку, вынуть ее из пробирки и держать в таком положении, не касаясь окружающих предметов.

Внимание! Класть пробку на стол или другие поверхности нельзя во избежание ее контаминации микроорганизмами (от лат. contaminatio — приведение в соприкосновение).

7. Края открытой пробирки обжечь в пламени спиртовки.

8. Ввести петлю в пробирку и, охладив ее о стенки пробирки, взять небольшое количество культуры с поверхности питательной среды.

Внимание! Питательный агар нельзя нарушать петлей.

9. Снова обжечь края пробирки в пламени горелки и закрыть ее, пронося пробирку сквозь пламя и надевая ее на пробку. Пробирку с культурой поставить в штатив.

10. Извлеченный из пробирки петлей материал внести в каплю воды на предметном стекле и после аккуратного перемешивания тонким слоем равномерно распределить по поверхности стекла.

11. Оставшиеся на петле клетки микроорганизмов тщательно сжечь в пламени горелки, после чего петлю поставить на место.

12. Суспензию микроорганизмов высушить в потоке горячего воздуха над пламенем спиртовки и зафиксировать, пронося 3-4 раза над пламенем (нельзя фиксировать невысушенные мазки).

13. После охлаждения стекло положить на мостик и окрасить метиленовым синим в течение 2 мин, следя по песочным часам.

14. Краску смыть водой, препарат осушить фильтровальной бумагой, осторожно прикладывая ее к предметному стеклу.

15. На окрашенный препарат нанести каплю кедрового масла. Предметное стекло положить на предметный столик, при помощи макровинта погрузить иммерсионный объектив (90х) в масло и найти микроскопическую картину, используя для установления четкости изображения микровинт.

Внимание! Нельзя использовать микровинт для поиска изображения микробов в препарате.

3.2. Приготовление прижизненных препаратов микроорганизмов

Прижизненные препараты используют для исследования микробов в живом виде с целью наблюдения их подвижности, прорастания спор, способа деления и т. д. Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов — «раздавленная капля» и «висячая капля».

Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносят из флакона каплю воды. В нее из пробирки вносят петлей небольшое количество исследуемой культуры и осторожно перемешивают, не размазывая по стеклу. Культуру, выращенную в жидкой среде (суспензию микроорганизмов), наносят на предметное стекло пипеткой.

Суспензию микроорганизмов накрывают сверху покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха, мешающих исследованию. Избыток выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой, прикладывая ее к краям покровного стекла.

На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом при опущенном конденсоре. Активно движущиеся бактерии проплывают через все поле зрения, меняют направления, совершают вращательные и круговые движения.

Препарат «висячая капля». Для приготовления такого препарата требуются специальное предметное стекло с лункой посередине и обычное покровное стекло. Края лунки предметного стекла смазывают вазелином. Небольшую каплю бульонной культуры микроорганизмов (суспензию) наносят на середину покровного стекла. Предметное стекло переворачивают лункой вниз и опускают ее на покровное стекло таким образом, чтобы находящаяся на нем капля суспензии приходилась на центр лунки.

Предметное стекло слегка прижимают к покровному, и стекла склеиваются. Препарат приподнимают и быстро переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметическая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно подготовленном препарате капля должна свободно свисать с покровного стекла и не соприкасаться с дном или краями лунки. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают с объективом 90х в затемненном поле зрения (при суженной диафрагме и опущенном конденсоре).

3.3. Приготовление препарата-отпечатка

Препарат-отпечаток используют для изучения естественного расположения клеток микроорганизмов на поверхности субстрата или пищевого продукта. Чистое предметное стекло фламбируют и прикладывают к поверхности исследуемого продукта (мяса, рыбы, сыра и т. п.). Препарат-отпечаток фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают метиленовым синим или по Граму. На препарат наносят каплю кедрового масла и микроскопируют с иммерсионным объективом.

3.4. Красители и индикаторы рН, используемые в микробиологической практике

Без окрашивания микроорганизмы (кроме грибов) не видны в световой микроскоп из-за их малой контрастности. В микробиологической практике окрашивание широко используют для определения формы, размеров, структуры, взаимного расположения микробов. Способы окрашивания фиксированных препаратов разделяются на простые и сложные. Для простых способов окрашивания микроорганизмов применяют основные и кислые анилиновые красители. У основных красителей хромофором (ионом, придающим окраску) является катион, у кислых — анион. Основные красители более интенсивно связываются с ядерными компонентами клетки. Кислые красители хорошо окрашивают цитоплазматические компоненты клеток.

К основным красителям относятся: красные — нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин;

✵ синие — метиловый синий, «Виктория»;

✵ фиолетовые — кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый;

✵ зеленые — янус зеленый, малахитовый зеленый, метиловый зеленый;

✵ черные — ни дул ни.

К кислым красителям относятся:

✵ красные и розовые — фуксин кислый, эозин, эритрозин;

✵ желтые — конго, пикриновая кислота, флуоресцин;

При простых способах окрашивания нельзя установить структуру микробов, а также зачастую их дифференцированное отношение к красителям. Для достижения этих целей применяют сложные способы окрашивания. К сложным способам относятся метод Грама (см. раздел 7.2), выявление кислотоустойчивости по Цилю-Нельсену, определение зерен полифосфатов по Леффлеру (см. раздел 6.3), выявление спор бактерий по Цилю-Нельсену или по Пешкову (см. раздел 7.4), выявление капсул по Гинсу-Бурри (см. раздел 7.5) и др.

Индикаторы рН — органические вещества, которые реагируют на изменение активной кислотности среды изменением ее цвета. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют кислотнощелочное соотношение среды, в которой они развиваются, поэтому индикаторы используют для регистрации этих изменений. Индикаторы, окрашенные в одной среде и бесцветные в другой, называют одноцветными, а индикаторы, имеющие разную окраску по ту и другую стороны интервала, называют двуцветными.

В микробиологии наиболее часто употребляются двуцветные индикаторы, приведенные в табл. 3.1.

Таблица 3.1. Двуцветные индикаторы

Источник

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.

При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:

1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало — в направлении источника света.
2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличения. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.
3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказалось хорошо освещенным.
4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат закрепляют с помощью клемм.
5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокусировки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

1	Прежде чем сменить объектив, рассматриваемый объект (или его участок) ставят в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении. Диаметр линзы уменьшается по мере возрастания степени увеличения, вследствие чего объект, если он лежит не в центре, при смене объектива может оказаться за пределами поля зрения.	Before changing the lens, the object in question (or its section) is placed in the center of the field of view of the microscope at low magnification. The diameter of the lens decreases as the magnification increases, as a result of which the object, if it is not in the center, may be out of sight when the lens is changed.
2	Слегка приподнимают тубус и затем переводят объектив с помо щью револьвера. Это необходимо потому, что объектив большего увели чения всегда бывает длиннее.	Slightly raise the tube and then transfer the lens with a revolver. This is necessary because the lens of higher magnification is always longer.
3	Для того чтобы в поисках фокусного расстояния не раздавить пре парат или, что еще хуже, не повредить линзу объектива, тубус с подведеннымпод него объективом, глядя для контроля сбоку микроскопа, опускают до самой поверхности препарата и затем, смотря в окуляр, очень медленно (чтобы не пропустить появления очертаний предмета) поднимают.	In order not to crush the preparation or, even worse, to damage the objective lens, while searching for the focal length, the tube with the objective underneath it, looking to control the side of the microscope, is lowered to the surface of the preparation and then, looking into the eyepiece, very slowly (so as not to miss the appearance of the outlines of the subject) raise.

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).

Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.

Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.

Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.

Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 — 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов

1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде — стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 — 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Источник