Способы приготовления препарата мазка

Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см 2 . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, — основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Источник

Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.

1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, которое затем удаляют салфеткой.

2 этап. Если микроорганизмы выращены на плотной питательной среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят петлей небольшое количество материала, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см 2 .

3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации

Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх

Мазок погружают в фиксатор на определенное время. В качестве фиксатора используют: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др.

Методы окраски

Простые методы (ориентировочные)

Сложные методы (дифференцирующие)

1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов.

2. Окрашивают одним красителем анилино-вого ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый.

1. Применяют для изучения структуры клеток, дифференциации микроорганизмов.

2. Используют несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера Гинса-Бурри и др.

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители. Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.

Окраска по Граму. Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму (этапы окраски по Граму представлены на стенде).

На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

Наносят раствор Люголя на 1 мин.

Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Препарат промывают водой.

Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска по Цилю-Нильсену

Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя — метиленового синего – окрашиваются в синий свет.

Методика окраски по Цилю-Нильсену:

На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

Снять бумагу, промыть мазок водой.

Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания.

Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Окраска по Ожешко

Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.

Методика окраски по Ожешко:

На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Методика окраски по Романовскому-Гимзе:

Краска Романовского-Гимзе состоит из метиленового синего, эозина и азура.

На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии — в фиолетовый цвет, лептоспиры — в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Источник

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.

При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:

1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало — в направлении источника света.
2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличения. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.
3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказалось хорошо освещенным.
4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат закрепляют с помощью клемм.
5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокусировки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

1	Прежде чем сменить объектив, рассматриваемый объект (или его участок) ставят в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении. Диаметр линзы уменьшается по мере возрастания степени увеличения, вследствие чего объект, если он лежит не в центре, при смене объектива может оказаться за пределами поля зрения.	Before changing the lens, the object in question (or its section) is placed in the center of the field of view of the microscope at low magnification. The diameter of the lens decreases as the magnification increases, as a result of which the object, if it is not in the center, may be out of sight when the lens is changed.
2	Слегка приподнимают тубус и затем переводят объектив с помо щью револьвера. Это необходимо потому, что объектив большего увели чения всегда бывает длиннее.	Slightly raise the tube and then transfer the lens with a revolver. This is necessary because the lens of higher magnification is always longer.
3	Для того чтобы в поисках фокусного расстояния не раздавить пре парат или, что еще хуже, не повредить линзу объектива, тубус с подведеннымпод него объективом, глядя для контроля сбоку микроскопа, опускают до самой поверхности препарата и затем, смотря в окуляр, очень медленно (чтобы не пропустить появления очертаний предмета) поднимают.	In order not to crush the preparation or, even worse, to damage the objective lens, while searching for the focal length, the tube with the objective underneath it, looking to control the side of the microscope, is lowered to the surface of the preparation and then, looking into the eyepiece, very slowly (so as not to miss the appearance of the outlines of the subject) raise.

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).

Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.

Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.

Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.

Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 — 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов

1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде — стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 — 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Источник