Гистохимия: методы Гистохимические методы: введение Буферные растворы и их приготовление Выявление нуклеиновых кислот Выявление (суммарное) белков Гистохимические методы для полисахаридов и протеидов Окрашивание жиров и липидов Металлы, анионы, экзогенные пигменты Гистохимия ферментов Гистохимия нервной системы
Буферные растворы и их приготовление
Химические процессы, протекающие в тканях организма, особенно с участием ферментов, требуют наличия ряда условий, среди которых важное значение имеет рН среды. Как известно, степень кислотности данного раствора зависит от концентрации ионов Н+ , а степень его щелочности — от концентрации ионов ОН-.
При определенной температуре произведение положительно и отрицательно заряженных ионов -величина постоянная. Зная один из показателей, можно определить другой. Исходя из этого положения, в химии принято обозначать кислотность или щелочность раствора условно через водородный показатель (рН), представляющий логарифм концентрации ионов Н+ , взятый с обратным знаком. Так, при рН 7,0 концентрация ионов Н+ равна концентрации ионов ОН- и раствор имеет нейтральную реакцию. Чем показатель рН меньше 7,0, тем концентрация ионов Н+ выше (ведь показатель с обратным знаком) и тем больше кислотность раствора. Наоборот, чем рН больше 7,0, тем меньше ионов Н+ в растворе и более выражены его щелочные свойства.
Различные ферменты требуют для проявления своей активности разные значения рН.
Так, оптимальное условие для действия щелочной фосфатазы при рН 9,0, тогда как для кислой фосфатазы требуется рН 5,0.
Чтобы обеспечить наилучшие условия для проявления активности гистохимически выявляемого фермента, необходимо, чтобы в среде инкубации поддерживалось значение рН, оптимальное для данного фермента. Это условие достигается введением в среду инкубации буферных смесей с заданными значениями рН. Наиболее распространенными буферными растворами являются фосфатный, ацетатный и трис-буфер.
Приготовление буферных растворов
Прежде чем дать прописи буферных смесей, необходимо напомнить, что для определения концентрации растворов реактивов приняты понятия молярность (М) и нормальность (N).
Молярность раствора (М) — количество грамм-молей вещества, содержащихся в 1 л раствора. Грамм-моль — молекулярная масса данного вещества, выраженная в граммах. Например, для приготовления раствора в концентрации 0,2 М необходимо на 1 л раствора взять вещество в количестве, равном 0,2 его молекулярной массы.
Нормальность (N) — количество грамм-эквивалентов в 1 л раствора.
Грамм-экивалент — количество данного вещества, химически равноценное в данной реакции 1 грамм-атому водорода.
Для сложных веществ — это количество вещества, соответствующее прямо или косвенно при химических превращениях 1 грамму водорода или 8 граммам кислорода.
Эоснования = Моснования / число замещаемых в реакции гидроксильных групп
Экислоты = Мкислоты / число замещаемых в реакции атомов водорода
Эсоли = Мсоли / произведение числа катионов на его заряд
Э H2SO4 = М H2SO4 / 2 = 98 / 2 = 49 г
Э Ca(OH)2 = М Ca(OH)2 / 2 = 74 / 2 = 37 г
Э Al2(SO4)3 = М Al2(SO4)3 / (2· 3) = 342 / 2= 57 г
Фосфатный буфер (рН 6,0—8,0).
А — 0,2 М КН2 РО4 (13,6 г соли в 1 л дистиллированной воды);
Б — 0,2 М Na2 НР04 (31,2 г Na2 НРО4 . 2Н2 О в 1л дистиллированной воды).
Для получения 100 мл буфера нужного рН следует слить растворы Аи Б в количествах, указанных в табл. 1.
Источник
Приготовление буферных растворов
Почему точность взвешивания так важна для качества буферного раствора?
Приготовление буферных растворов — распространенная процедура в химических и биохимических лабораториях. Буферный раствор — это смесь слабой кислоты и сопряженного с ней основания или слабого основания и сопряженной с ним кислоты. Буферные растворы позволяют поддерживать стабильный уровень pH другого раствора, смешанного с буферным. Если в раствор попадает небольшое количество другой кислоты или щелочи или они образуются в ходе химической реакции, буферный раствор не допустит изменения значения pH всего раствора. Поэтому буферы очень полезны в разных задачах, где требуется поддержание стабильного уровня pH. Другие названия буферных растворов — также pH-буферы, водород-ионные буферы или просто буферы.
Например, в крови человека содержатся естественные буферы для поддержания рН в диапазоне от 7,35 до 7,45 — именно при таком уровне могут нормально действовать энзимы. Поскольку активность энзимов зависит от pH, при проведении биохимических анализов необходимо поддержание этого параметра на постоянном уровне. Буферные растворы применяются в шампунях для предотвращения раздражения кожи, в детских лосьонах для противодействия росту бактерий, а также в растворах для контактных линз, чтобы уровень pH жидкости оставался совместимым с уровнем рН глаз.
Приготовление буферного раствора состоит из нескольких этапов: взвешивание компонентов, растворение компонентов, корректировка pH и дополнение до заданного объема. Поскольку итоговое значение pH в буфере зависит от соотношения кислоты и основания, чрезвычайно важно взвешивать компоненты с высокой точностью. Все используемое оборудование (весы, пипетки и рН-метр) должно быть правильно откалибровано и иметь достаточную точность.
Buffer Preparation
Видео: приготовление буферного раствора — простота, удобство и точность
Для приготовления буферного раствора нужны время и особая тщательность, иначе раствор не будет действовать так, как требуется. Если качество продукции или биохимических анализов зависит от качества буферных растворов, ошибки при приготовлении буферов недопустимы.
Посмотрите видео и узнайте, как можно сэкономить время и силы, если готовить буферные растворы с помощью технических весов и рН-метров МЕТТЛЕР ТОЛЕДО.
Перейдите в один из следующих разделов, чтобы узнать больше:
Как готовить буферные растворы? Стандартная процедура
Приготовление буферного раствора состоит из нескольких этапов: расчет концентрации и количества компонентов в соответствии с назначением и нужным объемом раствора; взвешивание компонентов; растворение компонентов; корректировка pH; дополнение до заданного объема; маркировка и документирование; использование раствора или его сохранение для применения в будущем.
Выберите рецептуру из базы данных.
Рассчитайте количество компонентов, указанных в рецептуре, в соответствии с требуемым объемом буферного раствора.
Взвесьте компоненты и поместите их в сосуд.
Растворите компоненты в подходящем растворителе (обычно в воде).
С помощью рН-метра проверьте и скорректируйте значение pH.
Долейте раствор до необходимого объема.
Переместите раствор в бутыль для хранения и нанесите на нее соответствующую маркировку.
Задокументируйте результаты.
Буферный раствор — это раствор, сохраняющий свой показатель pH при добавлении небольшого количества кислоты или основания. Буферный раствор состоит из слабой кислоты и сопряженного с ней основания. Постоянный уровень pH в буферном растворе поддерживается благодаря поглощению протонов, которые высвобождаются в ходе реакции, или высвобождению протонов, если в ходе реакции они поглощаются. К созданию буферных растворов привело открытие того, что частично нейтрализованные растворы слабых кислот или оснований не меняют pH при добавлении к ним небольшого количества сильной кислоты или основания.
Сопряженное основание — это кислота, потерявшая протон. HA ↔ H + + A — Кислота ↔ протон + сопряженное основание
Сопряженная кислота — это основание, которое приобрело протон. A + H + ↔ H + A Основание + протон ↔ сопряженная кислота
Так устанавливается равновесие между диссоциированной и недиссоциированной формами. Например, слабая уксусная кислота частично диссоциирует в воде, образуя ацетат-ион: CH3COOH ↔ H + + CH3COO -. Недиссоциированная уксусная кислота, ионы водорода и диссоциированный ион находятся в растворе в равновесии.
Ацетат натрия также диссоциирует в воде с образованием такого же ацетат-иона: CH3COONa ↔ Na + + CH3COO -. Недиссоциированный ацетат натрия, а также ионы натрия и ацетата находятся в растворе в равновесии.
Водный раствор смеси уксусной кислоты и ацетата натрия поэтому может поглощать ионы H + , добавляемые с кислотой, присоединяя ионы водорода к ацетатному основанию и образуя уксусную кислоту. Когда же в раствор попадают ионы OH — из-за добавления щелочи, они соединяются с молекулами кислоты (H + ) и образуют воду. Таким образом система пытается восстановить равновесие, и pH раствора остается на одном уровне. Так проявляется буферное действие раствора.
Что происходит после добавления кислоты в буферный раствор?
Когда к равновесной смеси слабой кислоты и ее сопряженного основания добавляется сильная кислота (с большим количеством H+), точка равновесия смещается влево в соответствии с принципом Ле Шателье.
Что происходит после добавления основания в буферный раствор?
Аналогичным образом, если в смесь добавляется сильное основание, то концентрация ионов водорода снижается меньше, чем ожидалось с учетом количества добавляемого основания. Это происходит потому, что точка равновесия смещается вправо, чтобы компенсировать потерю H + в реакции с основанием.
Разновидности буферных растворов
Буферные растворы, состоящие из слабой кислоты и ее сопряженного основания, считаются кислыми и имеют рН 7. Примером щелочного буфера может служить водный раствор гидроксида аммония (слабое основание) и хлорида аммония (сопряженная кислота), имеющий рН 9,25.
На что следует обращать внимание при приготовлении буферного раствора
Буферы работают наиболее эффективно, если их pH примерно равен pH исследуемой системы или раствора. При изучении энзимов в биологии человека необходима система, соответствующая pH крови (7,35–7,45), в противном случае энзимы будут функционировать неправильно. Если у буферной системы pH выходит за пределы требуемого диапазона, это также отрицательно повлияет на анализ.
Поэтому необходимо знать, как приготовить буферные растворы с заданным pH. Это можно сделать несколькими способами:
Корректировка pH Сначала кристаллическая кислота или основание растворяется в объеме воды, равном примерно 60–70 % от требуемого конечного объема буферного раствора. Показатель pH проверяется, а затем корректируется. Если используется кристаллическая кислота, то для коррекции pH применяют основание, не выделяющее ионы, способные нарушить параметры исследуемой системы. Если используется кристаллическое основание, то рН корректируется с помощью подходящей кислоты. После достижения требуемого pH в буферный раствор можно долить воду, чтобы получить нужный объем.
Смешивание с раствором кислоты или основания В этом методе раствор кислоты или основания смешивается с раствором соответствующей соли. Концентрация исходных растворов должна быть такой же, как и у целевого буфера. Соотношения смешиваемых растворов можно менять, чтобы получить различные значения pH итогового буфера. Можно также следить за изменением рН при добавлении одного раствора к другому.
Уравнение Гендерсона — Гассельбаха. Оценить pH буферного раствора можно по уравнению Гендерсона — Гассельбаха с помощью константы диссоциации pKa. Если слабая кислота (HA), находящаяся в растворе, диссоциирует на ионы водорода (H + ) и достигает равновесия с сопряженным основанием (A — ), константа диссоциации покажет силу кислоты в этой точке равновесия. Уравнение Гендерсона — Гассельбаха выглядит следующим образом:
где pKa — константа диссоциации слабой кислоты; [A-] — концентрация сопряженного основания в точке равновесия; [HA] — концентрация кислоты в точке равновесия.
Если в точке равновесия концентрации сопряженного основания и кислоты одинаковы, то pH равно константе диссоциации. В этой точке буферный раствор обладает максимальной буферной емкостью. Уравнение Гендерсона — Гассельбаха также используется для определения константы диссоциации слабых кислот посредством прямых измерений pH.
Преимущества универсальных буферных растворов Универсальные буферные растворы состоят из нескольких комбинаций кислотно-основных пар. Это позволяет использовать универсальные буферные растворы для поддержания уровня pH раствора в более широком диапазоне и, следовательно, в более широком круге задач.
Дополнительные советы по приготовлению и использованию буферных растворов
Разработайте стандартную операционную процедуру. Полезно задокументировать процедуру приготовления буферного раствора и следить за ее соблюдением всеми сотрудниками. Это обеспечит стабильность и воспроизводимость. В СОП должны быть указаны подробные данные об используемых материалах и точно описаны действия по добавлению компонентов и измерению pH. В СОП можно также включить многие из приведенных далее рекомендаций.
Используйте средства индивидуальной защиты. Необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), например защитные очки и одежду, особенно при работе с сильными кислотами или основаниями.
Проверяйте наличие микробиологических загрязнений (особенно при работе с биологическими препаратами). Перед использованием буферного раствора проверьте емкость на предмет микробиологических загрязнений. Микробиологические загрязнения особенно часто появляются в буферных растворах с рН, близким к нейтральному. Видимые признаки — некоторое помутнение раствора или осадок на дне.
Правильно работайте с pH-метром. Чтобы измерения pH были точными, pH-метры нужно регулярно калибровать и поддерживать в рабочем состоянии. Перед использованием электрод должен быть надлежащим образом подготовлен и заправлен достаточным количеством буферного раствора, чтобы диафрагма электрода была полностью в него погружена. Прежде чем снимать показания, обязательно дождитесь стабилизации значения pH, а после измерения промойте электрод дистиллированной водой. Проводите измерения рН-метром только при комнатной температуре или используйте электрод со встроенным датчиком температуры.
Учитывайте температуру. Диссоциация может зависеть от температуры. Буферный раствор необходимо готовить при той же температуре, при которой будет проходить анализ. Убедитесь также, что электрод был откалиброван при той же температуре, при которой проводятся измерения.
Следите за концентрацией. Буферные растворы часто разбавляют до концентрации, которая требуется для выполнения анализа. Однако изменение концентрации может повлиять на уровень диссоциации. Поскольку pH отражает концентрацию ионов водорода (H + ), изменение уровня диссоциации может привести к изменению pH. После разбавления уровень рН буферного раствора следует проверить еще раз.
