Способы повышения разрешающей способности оптических приборов

6.2. Микроскоп

Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.

Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.

6.2.1. Увеличение микроскопа

Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:

,

(6.5)

где – фокусное расстояние микрообъектива, – расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.

Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:

.

(6.6)

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:

.

(6.7)

Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:

.

(6.8)

Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.

6.2.2. Поле зрения микроскопа

Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:

.

(6.9)

При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.

6.2.3. Диаметр выходного зрачка микроскопа

Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:

.

(6.10)

где – передняя апертура микроскопа.

Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).

При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.

6.2.4. Разрешающая способность микроскопа

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

.

(6.11)

Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (), то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа: .

Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.

Иммерсия

Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (), кедровое масло (), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит .

Применение ультрафиолетовых лучей

Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит .

Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.

6.2.5. Полезное увеличение микроскопа

Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.

Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии , то угловое расстояние между изображениями этих точек . Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:

.

(6.12)

Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра (0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:

.

(6.13)

Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза ().

Источник

Качество изображения

Разрешающая способность микроскопа

Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. минимальным расстоянием, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. разрешающая способность зависит от числовой апертуры объектива, конденсора и длины волны света, которым освещается препарат. Числовая апертура (раскрытие) зависит от угловой апертуры и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и конденсора и препаратом.

Угловая апертура объектива — это максимальный угол (AOB), под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат. Числовая апертура объектива равна произведению синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды, находящейся между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива. N.A. = n • sinα где, N.A. — числовая апертура; n — показатель преломления среды между препаратом и объективом; sinα — синус угла α равного половине угла АОВ на схеме.

Таким образом, апертура сухих систем (между фронтальной линзой объектива и препаратом-воздух) не может быть более 1 (обычно не более 0,95). Среда, помещаемая между препаратом и объективом, называется иммерсионной жидкостью или иммерсией, а объектив, рассчитанный для работы с иммерсионной жидкостью, называют иммерсионным. Благодаря иммерсии с более высоким показателем преломления чем у воздуха, можно повысить числовую апертуру объектива и, следовательно, разрешающую способность.

Числовая апертура объективов всегда гравируется на их оправах.
Разрешающая способность микроскопа зависит также от апертуры конденсора. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет вид R=λ/2NA, где R — предел разрешения; λ — длина волны; N.A — числовая апертура. Из этой формулы видно, что при наблюдении в видимом свете (зеленый участок спектра — λ=550нм), разрешающая способность (предел разрешения) микроскопа не может быть > 0,2мкм

Влияние числовой апертуры объектива микроскопа на качество изображения

Объектив с достаточной апертурой (видны отдельные клетки)	Объектив с низкой апертурой (недостаточная апертура объектива )

Пути повышения оптической разрешающей способности

Выбор большого угла светового конуса, как со стороны объектива, так и со стороны источника освещения. Благодаря этому, возможно, собрать в объективе более преломленные лучи света от очень тонких структур. Таким образом, первый путь повышения разрешения — это использование конденсора, числовая апертура которого соответствует числовой апертуре объектива.

Второй способ — использование иммерсионной жидкости между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом. Так мы воздействуем на показатель преломления среды n, описанный в первой формуле. Его оптимальное значение, рекомендуемое для иммерсионных жидкостей, составляет 1.51.

Иммерсионные жидкости

Иммерсионные жидкости необходимы для увеличения числовой апертуры и соответственно повышения разрешающей способности иммерсионных объективов, специально рассчитанных для работы с этими жидкостями и, соответствующим образом, маркированными. Иммерсионные жидкости, помещенные между объективом и препаратом, имеют более высокий показатель преломления, чем воздух. Поэтому, отклоненные мельчайшими деталями объекта лучи света, не рассеиваются, выходя из препарата, и попадают в объектив, что приводит к повышению разрешающей способности.

Существуют объективы водной иммерсии (маркированные белым кольцом), масляной иммерсии (черное кольцо), глицериновой иммерсии (желтое кольцо), монобромнафталиновой иммерсии (красное кольцо). В световой микроскопии биологических препаратов применяются объективы водной и масляной иммерсии. Специальные кварцевые объективы глицериновой иммерсии пропускают коротковолновое ультрафиолетовое излучение и предназначены для ультрафиолетовой (не путать с люминесцентной) микроскопии (то есть для изучения биологических объектов, избирательнопоглощающих ультрафиолетовые лучи). Объективы монобромнафталиновой иммерсии в микроскопии биологических объектов не используются.

В качестве иммерсионной жидкости для объектива водной иммерсии используется дистиллированная вода, масляной иммерсии — природное (кедровое) или синтетическое масло с определенным показателем преломления.

В отличие от других иммерсионных жидкостей масляная иммерсия является гомогенной, так как имеет показатель преломления равный или очень близкий показателю преломления стекла. Обычно этот показатель преломления (n) рассчитан для определенной спектральной линии и определенной температуры и указывается на флаконе с маслом. Так, например, показатель преломления иммерсионного масла для работы с покровным стеклом для спектральной линии D в спектре натрия при температуре =20°С равен 1,515 (nD 20 = 1,515 ), для работы без покровного стекла (nD 20 = 1,520).

Для работы с объективами-апохроматами нормируется также дисперсия, то есть разность показателей преломления для различных линий спектра.

Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива.

Учитывая вышесказанное, ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом. При некоторых способах микроскопии для увеличения апертуры конденсора, иммерсионная жидкость (чаще дистиллированная вода) помещается между конденсором и препаратом.

Источник