Способы получения трансгенных организмов
Многие, наверное, слышали такие слова как ГМО, трансгенные организмы или просто трансгены. Мы постараемся разобраться, что же это такое и как их получают. Сейчас ученые способны переносить и встраивать гены из геномов одних организмов в геномы любых других организмов, относящихся ко всем царствам живого. Такие организмы со встроенными чужеродными генами и называют генетически модифицированными организмами — ГМО или трансгенными организмами. К настоящему времени уже создано много таких изменённых организмов. Это и бактерии, производящие инсулин, и другие необходимые человеку соединения, и животные, дающие, например, молоко со свойствами грудного женского молока, а также множество растений, которые или устойчивы к каким-то соединениям, например, к гербицидам, или сами вырабатывают какие-то полезные человеку белки, например, вакцины или антитела. ГМО создают с помощью генно-инженерных технологий или генной инженерии.
Генная инженерия — направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которой является получение организмов с новыми, в том числе не встречающимися в природе комбинациями наследственных свойств. В её основе лежат достижения молекулярной биологии и, прежде всего, установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Кроме того, успехам генной инженерии способствовала разработка возможности объединения in vitro (в пробирке) генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК, т.е. создание рекомбинантных молекул. Поэтому генную инженерию называют ещё и техникой рекомбинантных ДНК. Таким образом, генная инженерия — это совокупность приемов, позволяющих исследователю путём операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного — бактериям, растениям и др.).
Каковы возможности генной инженерии?
1. Можно «скрещивать» индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.
2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.
3. Заранее можно предсказать результат скрещивания, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).
Как же можно с помощью генной инженерии создать ГМО и какие методы существуют для этого?
Для того чтобы получить трансгенные организмы нужно выполнить несколько последовательных действий.
Во-первых, надо создать вектор, то есть самостоятельно реплицирующуюся молекулу ДНК. Термин репликация (от позднелат. replicatio — повторение) обозначает самовоспроизведение нуклеиновых кислот (обычно ДНК, у некоторых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности, т.е. последовательности, у которых структуры двух молекул соответствуют в пространстве, благодаря чему возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмолекулярных взаимодействий. Вектор способен включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Векторами они названы за способность осуществлять процесс переноса направленно, по желанию экспериментатора.
Во-вторых, надо знать, какой ген необходимо встроить в организм, чтобы придать ему желательные свойства, и иметь этот ген.
В-третьих, надо разработать методы переноса, чтобы векторная молекула с необходимыми генами проникла в клетки изменяемого организма и встроила в клеточный геном чужеродные гены.
И, в-четвертых, необходимо правильное конструирование векторной молекулы, чтобы встроенный ген полноценно экспрессировался в клетке. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Однако обычно их создают на основе ДНК плазмид или вирусов (в том числе бактериофагов).
Плазмиды — это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные размножаться (реплицироваться) в клетке независимо от цикла размножения клетки. «Дикие» плазмиды очень широко распространены в природных бактериальных популяциях и способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой в процессе «конью-гации» — аналога полового размножения. Многие плазмиды содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д. Наличие в плазмидах таких генов делает их присутствие в бактериальных клетках выгодным и способствует их размножению. Плазмиды стали настоящим подарком для молекулярных биологов, сейчас на их основе созданы многие современные «векторные» системы, используемые в генной инженерии. Если основная бактериальная ДНК имеет длину более 100 тысяч пар оснований, то размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. Они легко выделяются и очищаются.
Большое количество векторов создано на основе бактериофагов. Они позволяют вводить чужеродную ДНК в ДНК-фаг. Причем, вставляемый фрагмент ДНК может быть значительно большего размера, чем при использовании плазмидного вектора.
Ген, который хотят ввести в трансформируемый организм, чтобы придать ему новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса.
Ген можно получить несколькими путями.
1. Выделение гена из ДНК каких-то организмов, у которых определена нуклеотидная последовательность геномов и известна функция многих генов, например, из Arabidopsis thaliana, который является модельным растением во множестве исследований, или из бактерий, так как последовательность геномов многих бактерий в настоящее время известна. Выделение генов из ДНК проводят с помощью специальных ферментов рестрикт Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх до шести пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Однако этот метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать ферменты, которые могут точно вырезать из ДНК нужный ген. Вместе с последовательностью его нуклеотидов захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.
2. Выделение гена из ДНК с помощью химико-ферментного или ферментного синтезов. Таким способом ген можно синтезировать, зная первичную структуру белка, кодируемого желаемым геном, или с помощью обратной транскрипции РНК, выделенной из соответствующего организма. Термин транскрипция (буквально — переписывание, от лат. trans— через, пере и scribo — черчу, пишу) — это процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы; происходящий во всех живых клетках. Транскрипция катализируется ферментом, который называется ДНК-зависимая РНК-полимераза. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5- к 3- концу,
т.е. по матричной цепи ДНКРНК-полимераза движется в направлении 3->5. Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом.
СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ
Затем эту генетическую конструкцию встраивают в плазмиду, которую каким-либо образом вводят в клетку с тем, чтобы гены встроились в клеточный геном.
КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ?
Ti-плазмида представляет собой кольцевую двунитевую ДНК, которая несет гены, участвующие в образовании опухоли. В растение переносится часть плазмиды, которая называется Т-ДНК (от англ. transferred DNA, т.е. «переносимая ДНК»), на которой локализованы гены синтеза ферментов, вызывающих формирование опухолей на растении, а также гены синтеза опи-нов. Ti-плазмида содержит также wr-гены, которые экспрессируются под воздействием сигнальных молекул и являются ответственными за синтез, вырезание и перенос Т-ДНК, но сами в геном растения не переносятся.
На рисунке приведена схема генетической трансформации клетки. Фенольные компоненты пораненной растительной клетки запускают экспрессию генов vir-области Ti-плазмиды. vir-белки вырезают Т-область из плазмиды, образуя Т-цепь. Затем Т-цепь и vir-белки нескольких типов переносятся в растительную клетку через транспортные каналы. Внутри клетки vir-белки взаимодействуют с Т-цепью, формируя Т-комплекс. Этот комплекс попадает в ядро, позволяя Т-ДНК интегрировать в геном растения и экспрессировать встроенные гены
После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. При этом одна из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком ДНК клетки-хозяина может включиться в хромосому или внехромосом-ную единицу.
В растениях, трансформированных такими плазмидами, опухоли уже не образуются, и не происходит синтеза опинов. «Обманутая» человеком бактерия, внедряя свою ДНК в хромосому растения, в свою очередь «обманывает» геном растения, который после этого начинает синтезировать необходимые человеку продукты.
МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА ДНК В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ
В настоящее время применяются две основные группы методов переноса ДНК в клетки растений: прямые и агробактериальные.
I. Прямой перенос ДНК в растительную клетку
При этом способе используются различные химические и физические методы:
электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), ионов Са2+ и высокие значения рН. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако иногда без них не обойтись. В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, или ионов Са2+ и высокого рН) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты, т.е. клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань ферментами, растворенными в осмотике разрушающими пектин и целлюлозу — пек-тиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются многоатомные спирты (маннит или сорбит) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после переваривания клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых могут образоваться растения-регенеранты.
1. Электропорация основана на том, что импульсы тока высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты (Пр) и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350В, длительность импульса 30-60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цито-плазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил.
2. Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, протопластов ионов Са и высоких значений рН. В этом методе для трансформации также используют протопласты, добавляя к ним специальные соединения (раствор ПЭГ, хлористый кальций, щелочь), добавляют плазмиду и инкубируют в течение 20-30 мин. ПЭГ и ионы Са2+ воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза. Пиноцитоз (от греч. pfno — пью, впитываю и kytos — вместилище, здесь — клетка) — захват клеточной поверхностью жидкости с содержащимися в ней веществами. Один из основных механизмов проникновения в клетку высокомолекулярных соединений, в частности белков и углеводно-белковых комплексов. При пиноцитозе на плазматической мембране клетки появляются короткие тонкие выросты, окружающие капельку жидкости. Этот участок плазматической мембраны впячивается, а затем отшнуро-вывается внутрь клетки в виде пузырька. Пиноцитозные пузырьки способны перемещаться внутри клетки, сливаться друг с другом и с внутриклеточными мембранными структурами. В клетке мембранная оболочка растворяется, и ДНК встраивается в геном клетки.
3. Трансформация с помощью биологической баллистики (биолистика или бомбардировка). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно для трансформации однодольных видов. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносятся на пластиковую пулю и помещаются внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10-15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0.1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.
Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0.6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органельные геномы.
II. Перенос ДНК с помощью агробактерий
Другая наиболее распространенная группа методов — трансформация с помощью Л. tumefaciens или Л. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования в течение некоторого времени (от 2-3 мин до 2-3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation) растительных эксплантов, то есть кусочков каких-либо частей растения, которые затем переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий.
ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ТРАНСГЕННОСТИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ, Т.Е. НАЛИЧИЕ В ИХ ГЕНОМЕ ТРАНСГЕНА
ПОЛУЧЕННЫЕ К НАСТОЯЩЕМУ ВРЕМЕНИ ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
Кроме того, в настоящее время производят трансгенные растения не столько для питания, сколько для технических целей, например, для фиторемедиации почв, т.е. очищения загрязненных территорий с помощью растений, которые способны через корни поглощать различные соединения, расщеплять их и либо использовать для построения организма, либо накапливать без вреда для себя. Основная связанная с этим проблема заключается в том, что процесс очищения протекает очень медленно и полностью останавливается в зимний период. Поэтому во многих случаях использование растений для фиторемедиации не имеет практического смысла, т.к. регулирующие органы устанавливают достаточно жесткие сроки очищения загрязненных территорий. Сейчас для очистки почв применяют химические средства дезактивации или срезают верхний слой, проводя захоронение его в специальных местах. Однако можно заставить растения поглощать из почвы эти соединения, очищая её. Так, профессор биологии Норман Терри (Norman Terry) из алифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) с помощью генной инженерии более чем в пять раз увеличил способность растений индийской горчицы поглощать из почвы селен. Растение преобразовывало селен в безопасное летучее соединение, которое через листья выделялось в воздух. Терри полагает, что генетически модифицированные растения решат эту проблему намного дешевле всех прежних способов. Сейчас многие компании работают над тем, чтобы растения поглощали из почвы ртуть, медь и другие токсичные «тяжелые металлы».
Ученые Вашингтонского университета, университета штата Орегон и университета Пердью (штат Индиана), работающие под руководством доктора Шэрон Доти (Sharon Doty), утверждают, что созданные ими генетически модифицированные тополя в лабораторных условиях поглощают до 91% трихлорэтилена — наиболее частого загрязнителя грунтовых вод в США. Обычные растения поглощают не более 3% этого соединения. Кроме того, растущие в пробирках экспериментальные тополя, высота которых составляет всего несколько дюймов, расщепляют трихлорэтилен до безопасных соединений в 100 раз быстрее, чем не трансформированные растения.
Источник
