12.5. Получение различных ингредиентов крови
Получение дефибринированной крови. Кровь животного сливают в стерильную колбу со стеклянными бусами и непрерывно в течение 10–15 мин встряхивают. В результате встряхивания находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы, а дефибринированная кровь, слитая в другую колбу или пробирку, утрачивает способность свертываться.
Приготовление взвеси эритроцитов. Для освобождения от пленок фибрина дефибринированную кровь фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Фильтрат наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 2000–3000 об./мин в течение 10–15 мин. Эритроциты оседают на дно пробирки, а прозрачная, слегка желтоватого цвета плазма образует над-осадочный слой. После центрифугирования уровень жидкости в пробирке отмечают карандашом, отделяют плазму пастеровской пипеткой, эритроциты промывают, доливая до метки стерильный изотонический раствор хлорида натрия, и вновь центрифугируют. Промывание эритроцитов с добавлением свежего раствора производят 2–3 раза, чтобы последняя порция промывной жидкости была бесцветна.
Из промытых эритроцитов готовят 3 или 5 % взвесь, прибавляя к 3–5 мл эритроцитов соответственно 97–95 мл изотонического раствора хлорида натрия (для получения меньших количеств взвеси объемы обоих ингредиентов уменьшают в одинаковое число раз).
Взвесь эритроцитов можно хранить в холодильнике при температуре 3–4 °С в течение 5–6 дней.
Приготовление сыворотки крови. Кровь, собранную в стерильную пробирку, закрывают ватно-марлевой пробкой, ставят на 20–30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37 °С, так как в тепле кровь свертывается быстрее и лучше. При свертывании сгусток крови обычно прилипает к стенкам пробирки. Поэтому после выдерживания в термостате сгусток отделяют от стенок пробирки круговым движением капилляра стерильной пастеровской пипетки или стеклянной стерильной палочкой.
После отделения сгустка сыворотку ставят в холодильник при температуре 3–4 °С. В течение 3–4 ч сыворотка обычно отделяется полностью, и ее можно собрать стерильной пастеровской пипеткой. Чтобы содержимое пробирки было хорошо видно, пастеровскую пипетку соединяют со стеклянной трубкой – «мундштуком» (резиновая трубка длиной 20–25 см). Это позволяет избежать соприкосновения кончика пипетки со сгустком крови и попадания в сыворотку эритроцитов.
Окрашенную в розовый цвет сыворотку центрифугируют при 2000–3000 об./мин в течение 10–15 мин для осаждения форменных элементов крови.
При взятии крови вскоре после кормления животных, а также при повторных кровопусканиях с короткими интервалами иногда возникает липемия, т.е. появление избытка жировых веществ в крови. Сыворотки, получаемые во время липемии, бывают мутные (хилезные), иногда опалесцирующие, и это очень затрудняет чтение диагностических реакций, особенно реакции преципитации. Во избежание получения мутных сывороток кровь у животных берут натощак. Просветление липе-мической плазмы наступает также при введении в кровеносное русло животного гепарина, способствующего повышению концентрации в крови фермента, называемого фактором просветления. С этой целью кроликам весом 2–2,5 кг в краевую вену уха вводят за 1–1,5 ч до обескровливания 60 мг гепарина.
Сыворотку крови можно получить методом центрифугирования. В слитой с осадка сыворотке через короткое время после центрифугирования образуется сгусток фибрина, который уплотняется при перемешивании крови стеклянной палочкой. Затем этот сгусток удаляют. В некоторых случаях фибрин из сыворотки выпадает не полностью. Для удаления остатков фибрина и выявления полноты его удаления к сыворотке прибавляют несколько капель тромбина. Освобожденную от фибрина сыворотку фильтруют через асбестовые фильтры. Полученная таким способом сыворотка совершенно прозрачна и не имеет признаков опалесценции.
Приготовление цитратной крови. Полученную из сердца или вены кровь сливают в пробирку с 5 % раствором цитрата натрия (10 мл крови, 1 мл цитрата натрия). Цитратная кровь не свертывается.
Приготовление плазмы крови. Цитратную кровь ставят на 18–20 ч в холодильник или центрифугируют. В результате над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета – плазмы.
Источник
Способы получения плазмы крови
Лабораторная работа №1
Получение сыворотки и плазмы крови
Получение сыворотки. Для получения сыворотки кровь берут в стерильные пробирки, вымытые в растворе мыла и промытые дистиллированной водой. Сыворотка лучше отделяется, если перед взятием крови стенки пробирок смочить теплым физиологическим раствором. Пробирки должны иметь комнатную температуру, так как кровь плотно пристает к стенкам пробирок и наступает частичный гемолиз эритроцитов. Кровь ставят в термостат при температуре 37°С на 1 час. Затем переносят ее на холод. Через 4 часа сыворотка в виде прозрачной жидкости отделяется от кровяного сгустка. Для лучшего выделения сыворотки образовавшийся сгусток фибрина отделяют от стенок пробирок, обводя стеклянной палочкой или проволокой. С целью быстрого получения сыворотки свернувшуюся кровь центрифугируют при 2000-2500 об/мин. в течение 15-20 минут. Готовую сыворотку сливают в чистую сухую пробирку.
Получение плазмы крови. Цельная кровь, вышедшая из кровеносных сосудов, обладает способностью быстро сворачиваться, поэтому её необходимо стабилизировать антикоагулянтами. В настоящее время один из лучших антикоагулянтов – гепарин, так как использование других антикоагулянтов приводит к некоторому разбавлению крови, что в дальнейшем приходиться учитывать при проведении исследований. В отличие от других антикоагулянтов, гепарина достаточно 1 капли на 5 мл крови. Практически намного удобнее наливать в пробирку немного гепарина, смачивать им стенки пробирки и переливать в другую пробирку.
Рис. 1. Распределение плазмы и форменных элементов крови после центрифугирования
Кроме гепарина для получения плазмы крови в пробирку предварительно насыпают лимоннокислый натрий (из расчета 15-20 мг на 10 мл), щавелевокислые натрий, калий или аммоний (из расчета 30-15 мг на 10 мл).
Взятую в пробирку кровь быстро и хорошо смешивают с антикоагулянтом. Плазму отделяют от форменных элементов центрифугированием в течение 15-20 мин при 2000-2500 об/мин. При этом верхний, соломенно-желтого цвета, слой представляет собой плазму, нижний, красный, слой – это эритроциты, а еле заметный беловатый слой над эритроцитами – это лейкоциты (рис. 1).
Источник
Способы получения плазмы крови
Данный материал взят из книги “Диагностические тест-системы: Радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики” Таранова Анатолия Григорьевича и размещен на сайте с любезного разрешения автора.
ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ
2.1. Условия взятия и хранения биологического материала
Подготовка к проведению лабораторных исследований содержит два основных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращение деградации биологически активного вещества в образцах.
Перед получением образца крови медицинскому работнику необходимо знать следующее:
1) некоторые биологические вещества, например гормоны, после приема пищи могут иметь повышенную концентрацию; ,
2) содержание ряда веществ подвержено влиянию циркадных (суточных) колебаний;
3) множество лекарственных веществ способны влиять на определяемые вещества, повышая или понижая их уровень в крови;
4) взятие исследуемого образца у пациентов в горизонтальном, в вертикальном положении или после физической нагрузки изменяет уровень биологически активных веществ иногда более чем на 10 %.
Желательно, чтобы кровь, предназначенная для исследования, забиралась в однотипные центрифужные пробирки. Такие пробирки должен готовить (мыть, высушивать, добавлять коагулянт или ингибитор ферментов) один сотрудник. Кровь без добавок отстаивают, а с добавками центрифугируют, полученную сыворотку или плазму разливают в такое количество мелких пластмассовых или стеклянных пробирок (стекло не всегда выдерживает низкую температуру), которое равно или превышает число разных типов тестирования.
В биохимической деятельности организма большую роль играют биологические ритмы. Пульсирующий характер секреции многих веществ от нескольких минут до суток — все это должно быть учтено при взятии биологического материала. Вне связи с временным фактором и конкретным физиологическим состоянием не существует абсолютных нормативных показателей вещества. Если не преследуется специальная цель исследовать циркадный ритм биологической активности, периферическую венозную или капиллярную кровь у пациентов желательно брать утром натощак в одно и то же время, в условиях физиологического покоя, что особенно важно при исследовании веществ, секреция и метаболизм которых протекает в течение суток неодинаково.
Во время процедуры взятия крови следует избегать гемолиза, который некоторым возможен при длительном венозном застое, энергичной аспирации крови шприцем, попадании в просвет иглы воды и детергентов, действии на кровь высокой и низкой температур.
2.1.1. Получение сыворотки или плазмы крови
Цельная кровь (капиллярная и венозная) используется в основном в биохимических исследованиях (определение глюкозы, показателей КЩР, определение концентрации электролитов в эритроцитах) и гематологии (исследование LE-клеток, гематокрита, на малярию, проведение стандартного клинического анализа крови). Для радиоиммуиных и иммуноферментных методов получают сыворотку или плазму.
Вопрос о том, что лучше брать для анализа — плазму или сыворотку — не имеет однозначного ответа. Некоторые исследователи предпочитают сыворотку, так как стероиды, например, из нее экстрагируются легче и полнее, чем из плазмы. Кроме того, плазма нередко образует эмульсию с органическими растворителями во время экстракции, а после замораживания и оттаивания в ней появляются хлопья фибрина, мешающие определению. Для биохимических исследований чаще используется сыворотка венозной крови, полученной у пациента при определенных условиях.
При выборе вида материала следует учитывать следующее:
1) При получении сыворотки крови возникает опасность того, что при отстаивании крови из эритроцитов интенсивно освобождаются протеолитические ферменты, которые могут разрушить определяемое вещество и повредить его меченый аналог во время инкубирования. Поэтому для определения содержания белковых соединений предпочтительно готовить плазму крови.
2) При получении плазмы часто используют гепарин или цитрат. Первый блокирует связывание антитела с антигеном, второй существенно изменяет кислотность среды, к которой чрезвычайно чувствительны некоторые вещества. Поэтому в сухую центрифужную пробирку желательно насыпать 50 мг ЭДТА на 5 мл крови (1:100). Сразу же после забора кровь перемешать с ЭДТА и отцентрифугировать. ЭДТА является слабым антикоагулянтом, блокатором протеолитических ферментов и составной частью многих буферных смесей.
2.1.2. Обработка крови для лабораторных исследований
Полученная и доставленная в лабораторию кровь должна быть быстро обработана, или подвергнута исследованию. Длительное стояние сыворотки над эритроцитами может привести к сдвигам концентраций составляющих, поэтому время стояния сыворотки над сгустком должно быть ограничено. Кроме того, биологический полураспад некоторых исследуемых веществ настолько мал, что стояние сыворотки при высокой комнатной температуре может полностью исказить полученные результаты исследования.
В начале обработки чистой сухой стеклянной палочкой сгусток крови осторожно отделяется от стенок пробирки, пробирка взвешивается и подготавливается к центрифугированию.
Подавляющее количество лабораторных образцов для исследований рекомендуется центрифугировать при +4 °С, со скоростью вращения 500 — 1000 g (1500 — 3000 об/мин) не более 15 — 20 минут. Высокая скорость вращения, как правило, приводит к гемолизу сыворотки или плазмы.
Полученную сыворотку (плазму) необходимо быстро отделить от форменных элементов крови и плотно закрыть пробирки крышкой. Если получена липемическая или гемолизированная сыворотка, образец, как правило, выбрасывается.
2.1.3. Хранение крови (плазмы, сыворотки)
Для определения большинства биологического материала считается возможным хранение его при комнатной температуре не более 6-8 часов.
Некоторые образцы разрешается хранить в течение недели при + 4°С. При необходимости хранения сыворотки (плазмы) более суток, образец рекомендуется замораживать при -20°С, что позволяет проводить исследования, например, спустя несколько месяцев — раковые маркеры, мочевину, холестерин, большинство гормонов и т.д.
При работе с кровью общим правилом должно являться немедленное отделение плазмы или сыворотки от форменных элементов, так как некоторые вещества могут поглощаться и инактивироваться эритроцитами и лейкоцитами. Но даже в простых водных растворах они спонтанно окисляются (например, кортизол превращается в 21-дезоксикортизол).
Большинство веществ биологического происхождения при низкой температуре более стабильны, чем при комнатной, поэтому их обычно хранят в замороженном состоянии. В пробах крови после ее взятия происходит огромное количество процессов. Быстро размножающиеся бактерии и ферментативный гидролиз могут кардинально изменять состояние и содержание всех компонентов. Наиболее эффективным средством замедления и предотвращения таких изменений являются замораживание и быстрое центрифугирование. Однако, даже при –20 °С биологическая система не стабильна, поскольку активность многих ферментов при этом не изменяется. Естественным следствием этого является снижение концентрации веществ при длительном хранении при — 40, -70°С. На примере АКТГ видно, что температурный режим и физико-химические параметры среды имеют решающее значение для сохранности вещества. При хранении АКТГ в течение 18 месяцев при –17 °С его активность, измеряемая биологическим методом, не изменяется. При 37 °С через 45 минут гормон инактивируется на 64 %, через один день при комнатной температуре — на 85%, при 3°С — на 58%. Но кортикотропная активность кислого экстракта аденогипофиза, полученного гомогенизацией ткани в 0,1 % соляной кислоте, сохраняется при 2°С не менее 39 дней.
Плазму или сыворотку непосредственно после получения запаивают в стеклянные ампулы или помещают во флакончики с плотно закрывающимися крышками, замораживают и хранят при температуре не выше -20°С. При таких условиях образцы пригодны для анализа в течение нескольких месяцев, иногда до года. При повторном замораживании и оттаивании происходит частичная деградация белковых веществ (соединений), в то время как для веществ с малым молекулярным весом (например, стероидные гормоны) эти процедуры не столь опасны.
Образцы крови необходимо хранить в хорошо закрытых пробирках, так как потеря в образце влаги в замороженном состоянии может привести к концентрированию исследуемого вещества и получению в итоге ошибочного результата.
По экономическим соображениям важно до госпитализации и до любых терапевтических вмешательств взять образцы плазмы или сыворотки и поместить их в банк сывороток. После установления диагноза, если нет нужды в исследовании биологического материала, и образец не нужен для исследований, он может быть изъят из банка сывороток или плазм, однако, в наличия патологического процесса (особенно опухоли) возможно повторное определение уровня исследуемых веществ или их комбинаций. Кроме того, исследуемый образец рекомендуется оставлять в банке сывороток с тем, чтобы при модификации наборов фирмой-поставщиком, можно было корректно продолжить мониторинг больного. Этот подход также может оказаться полезным, если появится новый маркер, отличающийся более высокой чувствительностью и специфичностью.
При медленном замораживании образуются кристаллы льда, которые разрывают молекулы, особенно белковые, поэтому для оптимальной стабильности вещества необходимо быстрое замораживание. Лучше всего замораживание проводить с самого начала в жидком азоте — в этой среде процесс замораживания идет намного быстрее и не сопровождается разрушением охлаждаемых веществ. Нет общих правил относительно размораживания, однако эксперименты показывают, что следует избегать теплового шока образцов. Размораживание следует производить медленно и постепенно. Некорректно переносить образец сразу же из –20 °С в комнатную температуру, особенно учитывая сезонные различия температур помещения. Важно избегать повторного замораживания образца, лучше предварительно разделить его на несколько пробирок, чтобы не было проблем в случае повтора анализа.
Размораживание и повторное замораживание повреждает практически все биологические пробы. Существует ошибочное мнение о том, что такое воздействие не влияет на тиреоидные и стероидные гормоны. Действительно, структура молекул этих гормонов лучше сохраняется в таких ситуациях. Однако следует помнить, что основной пул стероидных и тиреоидных гормонов циркулирует под “защитой” транспортных белков, которые, как и все другие белки, не выдерживают температурных перепадов и, разрушаясь, перестают “защищать” гормоны. Последние, освобождаясь, немедленно включаются в метаболическую цепь, что, в конечном итоге, ведет к искажению истинной картины.
Химическое окружение, в котором находится препарат, также является важным фактором. При хранении белков в растворах концентрация этих белков всегда должна быть больше 1 мг/мл. Известно, например, что разбавленная антисыворотка теряет активность намного быстрее, чем неразбавленная. Молекулы некоторых веществ биологического происхождения особенно легко разрушаются при окислении, поэтому их надо хранить в присутствии какого-нибудь восстановителя или в атмосфере, не содержащей кислорода.
Учитывая высокую скорость разрушения биологически активных веществ в органах и тканях, извлечение их и приготовление навесок анализа необходимо проводить в условиях постоянного охлаждения, хранить образцы только в замороженном состоянии. Предварительная обработка материала позволяет значительно увеличить его срок хранения. Например, после обработки гипофиза ацетоном первоначальный уровень гонадотропной активности сохраняется в нем при хранении в холодильнике без замораживания не менее года. Экстракты гормонов и чистые препараты сохраняются гораздо дольше, чем нативные образцы.
Известно, например, что в тканях гипоталамуса рилизинг-фактор к лютеинизирующему гормону подвергается сравнительно быстрому метаболическому разрушению. В то же время при хранении в стерильных условиях растворов синтетического ЛГ-рилизинг-гормонов в течение 18 месяцев при 40 °С он полностью сохранял свою биологическую активность и иммунореактивные свойства.
2.1.4. Получение, обработка и хранение мочи
Сбор мочи для определения биологически активных веществ проводят в течении заданных интервалов времени, чаще всего за сутки. На протяжении суток скорость образования и экскреции вещества с мочой колеблется весьма значительно, но эти колебания нивелируются при исследовании суточной порции мочи. В последнее время появляется возможность определять не в суммарной суточной моче и не суммарные вещества, а конкретные вещества и в любое время суток. Например, определение андрогена надпочечникового происхождения дегидроэпиандростерона-сульфата, или 17-окси-прегненолона, предназначенного для выявления адреногенитального синдрома.
Из рациона человека, по меньшей мере, за трое суток до сбора мочи
необходимо исключить продукты и лекарственные препараты, влияющие на
секрецию и метаболизм ряда веществ. Присутствие в моче некоторых
веществ эндогенного и экзогенного происхождения может искажать
результаты определения веществ. Сбор мочи производят в сосуды из дифферентного материала (стекла, пластмассы) во избежание разрушения вещества.
При сборе мочи также соблюдают определенные предосторожности, ли моча не содержит стабилизаторов, как, например, при определении стероидов и их метаболитов, она должна храниться до анализа в замороженном виде (как правило, не более 10 дней). Замороженную мочу со стабилизатором, предназначенную для определения катехоламинов, допускается хранить не более трех дней.
2.1.5. Получение экссудатов и транссудатов
Перед сбором экссудатов и транссудатов в посуду для сбора рекомендуется добавить 2 капли гепарина или на кончике ножа сухого цитрата натрия для предотвращения свертывания. Жидкость собирается в чистую сухую посуду и немедленно доставляется в лабораторию.
2.1.6. Сбор и хранение кала
Для исключения возможных погрешностей в диагностике запрещено доставлять кал после использования клизм, введения свечей, приема внутрь касторового и вазелинового масел и красящих веществ. Кал, взятый для исследования на дисбактериоз, должен быть срочно доставлен в лабораторию, или поставлен в холодильник при 4°С. При исследовании на простейшие запрещено сохранять кал в термостате или теплой воде, поскольку при этом происходит гибель и регенеративные изменения простейших.
2.1.7. Сбор и хранение мокроты
Мокроту рекомендуется собирать при кашле в сухую чистую посуду не более суток, так как при длительном хранении происходит разложение флоры и аутолиз элементов мокроты. Кратковременное хранение ее рекомендуется проводить в холодильнике при 4°С. Для бактериологических исследований мокрота не должна стоять более 4 часов с момента получения.
2.1.8. Сбор и хранение ликвора
Спинномозговая жидкость (ликвор), полученная при люмбальной пункции или пункции желудочков мозга, собирается в сухую чистую посуду и доставляется в лабораторию немедленно, так как при хранении в связи с разрушением клеточных элементов результат исследования может быть недостоверным.
2.2. Обработка лабораторной посуды
В специальных пособиях приводится много советов по тех лабораторных работ, поэтому мы ограничимся лишь некоторыми рекомендациями, имеющими существенное значение для постановки реакции и получения высококачественного результата в радиоиммунных и иммуноферментных методах диагностики. При работе с буферными системами, органическими растворителями и другими веществами, применяемыми для постановки реакции, особое внимание нужно обращать на чистоту реактивов. Вода для буферного раствора должна быть бидистиллированной и деионизированной. Органические растворители, как правило, подлежат очистке (например, эфир пропускается через колонку с оксидом алюминия) и двойной перегонке с дефлегматором (напр., при получении абсолютного этанола).
Лабораторная посуда должна быть тщательно обрабатывается механическими и химическими способами.
Приготовление моющего раствора:
на 1 л дистиллированной воды 20 г порошка типа «Лотос».
Приготовление хромовой смеси:
в фарфоровом стакане растворяют 50 г бихромата калия (K 2 Cr 2 O 7 ) в 100 мл воды. Раствор сливают в сосуд большего размера и добавляют (очень осторожно) 1 л серной кислоты (концентрированной).
Внимание! Добавлять серную кислоту в раствор, но не наоборот!
2.2.1. Обработка посуды с низкой радиоактивностью
Флаконы — снять надписи с крышек ватой, смоченной в спирте, снять крышки в коробку с надписью “грязные крышки”, слить из флаконов сцинтилляционную жидкость в сосуд для жидких радиоактивных отходов, под струей горячей воды прополоскать флаконы от толуола (до исчезновения запаха), загрузить в бак с моющим раствором, оставить на ночь. На следующий день промыть флаконы сначала под струей холодной воды (налить-вылить 10-15 раз), затем также под струей горячей воды и окончательно под струей дистиллированной воды. Сушить в сушильном шкафу при температуре 150-200 °С вниз горлышком.
Пробирки — снять надписи ватой, смоченной спиртом, промыть под струей горячей воды (налить-вылить 10-15 раз), высушить в термостате или сушильном шкафу при температуре до 150 °С, дать остыть и загрузить в (хромовую смесь на 2-3 часа, (БУДЬТЕ ПРЕДЕЛЬНО ОСТОРОЖНЫ!) , вынуть их из хромовой смеси и промыть как флаконы (см. выше).
Крышки — тщательно протираются ватой, смоченной спиртом (два тампона на крышку), высушиваются при комнатной температуре и хранятся в коробке с надписью “чистые крышки”.
2.2.2. Обработка посуды с высокой радиоактивностью
Флаконы — обрабатывать 96° спиртом: заполнить флакон спиртом, перелить спирт во второй флакон, затем в третий, . в десятый, слить в сосуд для жидких радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Последующая обработка флаконов аналогична обработке флаконов с низкой активностью. Крышки загрузить в сосуд, залить ацетоном или 96° спиртом с полным погружением крышек, перемешать 3-5 мин, стеклянной палочкой, жидкость слить в емкость для радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Разложить на фильтровальной бумаге в один слой и сушить в вытяжном шкафу. Хранить в коробке с надписью “чистые пробирки”.
Все вышеописанные работы проводить только в вытяжном шкафу при полном отсутствии открытого огня.
Для выполнения биохимических исследований в лаборатории посуда проходит определенный цикл обработки в соответствии с требованиями санитарно-гигиенических и противоэпидемических служб. При выполнении в лабораториях коагулологических исследований или проведения исследований определения ряда пептидных гормонов биологическими методами помимо обычной чистой стеклянной посуды используют силиконированную посуду для взятия и хранения крови и плазмы.
2.2.3. Силиконирование посуды
Силиконирование посуды осуществляют для предотвращения контаминации исследуемого образца со стеклом, в котором проводят химическую реакцию. Силиконирование тормозит активацию свертывания крови, предохраняя распад некоторых веществ (например, пептидных гормонов) при инкубации их со встряхиванием.
Стекло покрывается мономолекулярной пленкой силикона:
5% раствор дихлордиметилсилана в толуоле. Чистая сухая посуда заполняется раствором и сразу же выливается. Силиконирование проводят в вытяжном шкафу, затем проводят сушку посуды в сушильном шкафу 180°С в течение часа.
Раствор для силиконирования хранят в посуде с притертой пробкой
в вытяжном шкафу.
Использовать силиконированную посуду не более 5 раз, затем силиконирование необходимо повторить.
Источник
