Способы получения каллусной ткани

Получение культуры каллуса, суспензионных культур и одиночных клеток

Основным типом поверхностно культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений.

Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, (первичный каллус) представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и по­этому может быть использована для получения суспензионной культуры. Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной (обратно) дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции (плотности) каллуса. Так каллусная культура средней плотности уже характеризуется хорошо выра­женными меристематическими очагами. В ней легко инициируют­ся процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов, которые могут дать начало целым растениям.

Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им неограниченный рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза, т.е. не являются тотипотентными. Каллусные клетки в культуре иногда могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов. Потеря гормонозависимости приводит к тому, что такие клетки не могут претерпевать вторичную дифференцировку, что не позволяет использовать такие клеточные культуры для получения вторичных метаболитов

В естественных условиях каллусная ткань может возникнуть у растений в результате механических повреждений. Она функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.

Методика искусственного получения каллусной культуры у растений хорошо отработана и не вызывает затруднений. Для того чтобы получить культуру ткани, из любой части растения (стебель, лист, элемента цветка, корень и т.д.), вычленяют эксплантат (кусочек ткани размером 0,5 — 1,0 см), стерилизуют его и помещают на питательную среду определенного состава.

Важнейшую роль в индуцировании каллусообразования на эксплантатах является наличие в питательных средах специфических фитогормонов – ауксинов и цитокининов. Функции этих двух групп фитогормонов в каллусогенезе различны, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки и последующей вторичной дифференцировки клеток и подготавливают их к делению, а цитокинины инициируют деление. Во время процесса дедифференцировки, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные, индивидуальные черты исходной ткани (потерять некоторые органеллы, в частности хлоропласты и некоторые запасные вещества, такие как крахмал, некоторые белки и липиды).

Различные типы фитогормонов, и, прежде всего их соотношение в среде культивирования, играют определяющую роль и во вторичной дифференцировке каллусных клеток.

Через несколько дней на изолированном кусочке ткани растения образуется первичный каллус. Периодически в асептических условиях его от­деляют и переносят на свежую питательную среду для дальнейшего роста. Такую ткань можно поддерживать в культуре неограни­ченно длительное время, периодически расчленяя ее и пересаживая на свежую питательную среду. Рост пересаженных тканей происходит в контролируемых условиях при температуре 24-28°С.

Формирование каллуса длится обычно 1-2 месяца. Периодичность субкультивирования тканей зависит от скорости роста биомассы. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от кото­рого она была получена, но ее клетки несут генетическую информа­цию, свойственную данному виду. Процессы, происходящие в культи­вируемых тканях, в принципе не отличаются от идущих в тканях це­лого растения. Сохранение способности к синтезу специфических вторичных метаболитов — алкалоидов, эфирных масел, карденолидов, сте­роидов и др. — определяет практическую ценность культур расти­тельных тканей для создания технологий промышленного выращивания биомассы клеток в качестве принципиально нового вида лекарствен­ного сырья. Кроме того каллусные клетки сохраняют свойство тотипотентности, что используется в технологии моноклонального размножения растений.

Другим вариантом культивирования растительных клеток является суспензионная культура, которую вы­ращивают в жидкой питательной среде, по аналогии с процессом глубин­ного культивирования в промышленной микробиологии.

Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных культур. В условиях глубинного культивирования значительно легче контролировать метаболизм и рост клеточных популяций с помощью различного рода экзогенных факторов. Суспензионные культуры намного удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и характеристик получаемых мутантов и т. п.

Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для полу­чения суспензионных культур пред-почтительнее брать каллусы рых­лого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са 2+ . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2-4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-D) или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добав­лении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно полу­чить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном авто­матическом перемешивании. Дедифференцированные клетки от­рываются от экспланта, образуя в питательной среде суспензию, состоящую из клеточных агрегатов различного состава. Качество суспензии определяется степенью агрегированности. Агрегаты должны содержать не более 10-12 клеток. Состояние клеточных суспензий характе­ризуется плотностью клеточной популяции. За 14 — 16 дней (сред­няя длительность культивирования) плотность обычно повышается от 5•10 4 до 5х10 6 кл/мл.

Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирова­ния клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в при­сутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следо­вательно, можно сказать, что суспензионные культуры представ­лены разными агрегатами каллусных клеток.

Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехноло­гии. Их культивируют в больших количествах для получения вторич­ных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разоб­щены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить макси­мальный выход продукта.

Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Однако культивирование одной или нескольких клеток связа­на с определенными трудностями, состоящими в том, что оди­ночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые раз­работаны для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток по­требовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего факто­ра» — совокупности метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или не­большое их количество, они не делятся, так как выделяемого кон­диционирующего фактора не хватает для индукции деления. Сле­довательно, необходимо повысить концентрацию фактора в пи­тательной среде. Этой цели служат следующие методы:

1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выде­ляется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки» (рис. ).

2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор вы­деляют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. ).

3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добав­ления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.

4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме (-20 мкл) богатой пита­тельной среды.

Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям), этот фактор водорастворим, термоста­билен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекуляр­ные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной плас­тиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин по­местить микропористый целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление оди­ночных клеток (рис. ).

Клетки животных так же способны расти либо в виде суспензий, либо прикрепленными к плотному субстрату (твердой поверхности). Такие клетки как, HeLa (клетки, происходящие из опухоли человека) могут расти в любом из этих состояний неограниченно долго; лимфобластомные клетки растут в суспендированных культурах; а нормальные диплоидные клетки способны расти только будучи прикрепленными к твердой поверхности и в виде монослоя (монослойное культивирование). Как только вся поверхность будет покрыта клетками, развитие культуры резко тормозится (контактное торможение), снижается синтез целевых метаболитов и происходит перерождение или отмирание клеток. Для предотвращения этих нежелательных процессов приходится периодически проводить пересев (перевивку) культуры на свежую питательную среду и новую поверхность. При этом нормальные (неопухолевые) клетки могут выдерживать от 20 до 50 делений и далее подвергаются дегенерации и погибают.

Монослойное культивирование животных клеток во многом определяется доступностью поверхности для их прикрепления, вследствие чего многие конструкторские разработки направлены на создание методов увеличении возможной площади прикрепления. Ранние технологии основывались преимущественно на использовании вращающихся пробирок или флаконов с целью лучшего обеспечения растущих клеток питательными веществами и воздухом.

Создаваемые в последнее время системы предназначаются для поддержания роста клеток на свернутых в виде «бухт» проницаемых для газов тефлоновых трубочках, каждая из которых имеет поверхность около 10 000 см 2 (а общее их число в реакторе более 20). В таких условиях многие типы клеток культивируются довольно хорошо. Еще одним перспективным способом культивирования клеток животных является способ, основанный на использовании небольших бусин (шариков, микроносителей), к которым прикрепляются клетки. Шарики могут изготавливаться из сефадекса (химически модифицированный крахмал) и обладать поверхностью в 7 см 2 на 1 мг. Шарики способны плавать в суспендированном состоянии и на них могут расти клетки различных типов. Таким путем уже получают человеческий интерферон. Данный способ, полагают, способен заменить метод монослойных культур.

В отличии растений культивирование фрагментов или целых органов животных представляет значительно более сложную задачу. Это связано с тем, что очень сложно создать для них необходимые условия из — за повышенной потребности в питательных веществах и кислороде. Так кусочки печени растут в питательной среде при содержании в газовой фазе 95% О₂ и 5%СО₂. Длительное культивирование целых взрослых органов пока представляет собой неразрешимую задачу. Гораздо легче удается культивировать различные эмбриональные органы и их фрагменты. Особенно перспективным представляется в настоящее время культивирование так называемых стволовых клеток (аналоги меристемных клеток растений).

Источник

Каллусные клетки и ткани. Каллусогенез. Дифференцировка тканей

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВКА КАК ОСНОВА КАЛЛУСОГЕНЕЗА

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об­разуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникно­вение каллуса связано с неорганизованным делением (пролифе­рацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка — это возвращение клеток в меристематическое состояние, при кото­ром они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вслед­ствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Обязательное условие дедифференцировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок-сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин. Функции этих двух групп гормонов в каллусогенезе разные, но они тесно связаны между собой. Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. Последние исследования свидетельствуют, что аук­сины индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного де­ления Рз4 сас2 , а цитокинины — циклинов. Таким образом, дей­ствие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду. Кроме того, оно будет зависеть от физиологического состояния клеток экспланта, от их компетентности к действию тех или иных внешних факторов. Ре­зультаты исследований показали, что полисахариды и какие-то неизвестные индукторы тоже могут вызывать деление клеток, при­водящее к образованию каллуса.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, бел­ки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласта, но возрастает число амилопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраи­ваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in vitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранив­шихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет

образовываться первичный каллус. Таким образом, специализи­рованная клетка растительной ткани становится каллусной в ре­зультате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способ­ности к делению.

ТИПЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

В зависимости от способа, условий культивирования и проис­хождения можно выделить несколько типов культур клеток и тка­ней. Если культивирование происходит поверхностно на агаризованной питательной среде, то образуется каллусная ткань. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определят, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плот­ной. Рыхлая каллусная ткань имеет сильно оводненные клетки, легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и по­этому может быть использована для получения суспензионной культуры. Ткань средней плотности характеризуется хорошо выра­женными меристематическими очагами. В ней легко инициируют­ся процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов:

Существует также суспензионная культура клеток, которую вы­ращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубин­ное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для полу­чения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рых­лого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са 2+ . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2,4-D или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). Наилучший эффект достигается при добав­лении ферментов. Суспензионные культуры клеток можно полу­чить и непосредственно из экспланта по методу Ф. Стюарда. Для этого эксплант помещают в жидкую среду при постоянном авто­матическом перемешивании. Дедифференцированные клетки от­рываются от экспланта, образуя суспензию в питательной среде. Постоянное встряхивание — необходимое условие культивирова­ния клеточных суспензий. Суспензионные клетки делятся в при­сутствии тех же двух групп гормонов (ауксинов и цитокининов), которые индуцируют деление клеток в каллусных тканях. Следо­вательно, можно сказать, что суспензионные культуры представ­лены разными агрегатами каллусных клеток.

Клеточные суспензии играют значительную роль в биотехноло­гии. Они могут быть использованы для получения изолированных протопластов, которые применяют для клеточной селекции, при введении чужеродных ДНК и других процессах. Клеточные суспен­зии культивируют в больших количествах для получения вторич­ных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы. Однако увеличение клеточной биомассы в результате деления клеток и синтез вторичных метаболитов разоб­щены во времени. Поэтому необходимо хорошо знать физиологию, свойства клеток в суспензионных культурах, чтобы получить макси­мальный выход продукта. Состояние клеточных суспензий характе­ризуется плотностью клеточной популяции. За 14 —16 дней (сред­няя длительность пассажа) плотность обычно повышается от 5-10 4 до 5-10 6 кл/мл. Качество суспензии определяется степенью агрегированности. Агрегаты должны содержать не более 10 — 12 клеток.

Большой интерес представляет культура одиночных клеток. Ее применяют в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, а также для генетических и физиологических исследований. Например, вопрос о причинах генетической неод­нородности легче решать, используя клон-потомство одной клет­ки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта.

Однако культивирование одной или нескольких клеток связа­но с определенными трудностями, состоящими в том, что оди­ночная клетка живет, но не делится в тех условиях, которые раз­работаны для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Поэтому при культивировании одиночных клеток по­требовалась выработка специальных методов. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего факто­ра» — метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или не­большое их количество, они не делятся, так как выделяемого кон­диционирующего фактора не хватает для индукции деления. Сле­довательно, необходимо повысить концентрацию фактора в пи­тательной среде. Этой цели служат следующие методы:

1. Метод ткани-«няньки» — кондиционирующий фактор выде­ляется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-«няньки» (рис. 7.1).
2. Метод «кормящего слоя» — кондиционирующий фактор вы­деляют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка (рис. 7.2).
3. Кондиционирование среды — осуществляется путем добав­ления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток.
4. Метод культивирования одиночных клеток — осуществляется в микрокапле, т.е. в очень малом объеме («20 мкл) богатой пита­тельной среды (Ю.Ю.Глеба).

Точно сказать, что представляет собой кондиционирующий фактор, пока невозможно. Согласно исследованиям А.И.Павло­вой и Р. Г. Бутенко (1969), этот фактор водорастворим, термоста­билен, не заменяется фитогормонами, включает низкомолекуляр­ные вещества. Химическая природа кондиционирующего фактора доказывается с помощью довольно простого эксперимента. Если разделить одиночные клетки и ткань-«няньку» стеклянной плас­тиной, то деления клеток не наступает. Если вместо пластин по­местить целлофан, то хотя и с задержкой начинается деление оди­ночных клеток (рис. 7.3).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК

Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Дифференцировку каллусных клеток принято называть вторичной. Однако ее не следует путать с вто­ричной дифференцировкой, на которой основан морфогенез. Рост каллусных тканей подчиняется общим закономерностям. Кривая роста каллусных тканей также имеет характер 5-образной кривой (ростовая кривая Сакса) и включает пять фаз, длительность кото­рых неодинакова у разных видов растений (рис. 7.4).

Первая фаза — латентная, или лаг-фаза, заключается в подготов­ке клеток к делениям. Вторая — фаза экспоненциального роста (лога­рифмическая). В это время митотическая активность наибольшая, рост идет с ускорением, масса каллуса увеличивается. Третья фаза — линейная, характеризу­ется постоянной скоростью ро­ста каллусной массы. Четвертая — фаза замедленного роста, во вре­мя которой интенсивность деле­ния клеток резко снижается. Во время пятой фазы — стационар­ной — масса каллуса не увели­чивается, так как начавшееся от­мирание клеток еще компенси­руется за счет их деления. Далее следует отмирание каллуса.

Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют мно­гие физиологические особенно­сти, свойственные клеткам рас­тения, из которого они были по­лучены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, способность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные только для них особенности. Например, длительно куль­тивируемые in vitro клетки высших растений, как каллусные, так и суспензионные, образуют специфическую популяцию, относящую­ся к типу неполовых, — популяцию соматических клеток. Наиболее характерные свойства этой популяции — физиологическая асинхронность и генетическая гетерогенность.

Физиологическая асинхронностъ — наиболее важное свойство не­половой популяции. Оно заключается в том, что в каждый дан­ный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее фи­зиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток.

Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны:

1. Особенности вида, сорта, генотипа индивидуального расте­ния, а также особенности экспланта.
2. Стрессы культивирования, например неоптимальная для дан­ного вида клеток среда.
3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в течение выращивания.
4. Генетическая гетерогенность клеток и клонов.
5. Аномалия митотического цикла клеток in vitro.
6. Физические факторы (температура, свет, аэрация).

Асинхронность — устойчивое свойство популяции каллусных клеток. Если с помощью специфических воздействий синхрони­зировать пролиферацию клеток популяции, то уже через 3—4 де­ления она вновь становится асинхронной.

Генетическая гетерогенность — свойство клеток соматической популяции (нестабильность генома и их генетическая гетероген­ность). Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при куль­тивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хро­мосомные аберрации, генные мутации. Однако генетическую ге­терогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием существования популяции кле­ток и служит основой для их адаптации.

В качестве причин появления генетической гетерогенности можно назвать следующие:

1. Генетическая гетерогенность исходного материала. В растени­ях клетки характеризуются различной плоидностью, диплоидны только активно делящиеся меристематические клетки.
2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первично­го экспланта из растения.
3. Действие компонентов среды. Экзогенные гормоны и стиму­ляторы могут оказывать мутагенное действие. Ауксины, особенно
   2,4-D, входящие в состав питательных сред, — мутагены; цитокинины способствуют полиплоидизации клеток.
4. Длительное субкультивирование, при котором накапливают­ся генетически измененные каллусные клетки.

После 5 — 6 пересадок новый кариотип клеточной популяции, как правило, стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физичес­ких или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям.

Генетическая нестабильность каллусных клеток имеет большое значение для селекционной работы, так как позволяет отбирать штаммы клеток с измененным генотипом. Эти клетки могут обла­дать уникальными свойствами: повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам, повышенной продуктивностью и т.д. Однако генетическая гетерогенность популяций каллусных кле­ток в культуре не влияет на сохранение в их геноме основных качеств вида и растения-донора.

Гормоннезависимостъ. Хотя гормоны и вызывают мутации, кал­лусные ткани от большинства растений образуются только в при­сутствии в питательной среде и ауксинов, и цитокининов. Ис­ключение составляют, например, незрелые зародыши пшеницы и семядоли подсолнечника. Первые образуют каллусную ткань на питательной среде с 2,4-D, но без цитокининов. Вторые, на­против, — на среде, содержащей цитокинины, но без ауксинов.

Вероятно, такая специфика связана с эндогенным содержанием фитогормонов и с компетентностью клеток. Однако при длитель­ном культивировании практически у всех тканей может возникать специфическое свойство гормоннезависимости, т.е. автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на опухолевые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Внешне же та­кие гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свой­ство автономности от присутствия в среде гормонов, называются «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клет­ками, называют «химическими опухолями» в отличие от расти­тельных или генетических опухолей. Генетические опухоли возника­ют на межвидовых гибридах растений. Растительные опухоли име­ют бактериальное или вирусное происхождение. Чаще всего расти­тельные опухоли возникают при попадании в растения агробактерий. Так, Agrobacterium tumefaciens вызывает образование коронча­тых галлов, A. rhizodenes — бородатого корня, A. rubi — стеблевого галла. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называе­мой Ti-плазмиды, которая значительно изменяет свойства клет­ки, в том числе экспрессирует гены, контролирующие синтез аук­синов и цитокининов. Гормоннезависимость «привыкших» клеток связана с изменением активности собственных генов, ответствен­ных за синтез белков-ферментов, участвующих в синтезе гормо­нов. Таким образом, «привыкшим» тканям и растительным опу­холям в равной степени свойственна гормоннезависимость, но у растительных опухолей она носит генетический характер. У «при­выкших» клеток это свойство достигается главным образом за счет эпигеномных изменений. Существует еще одна особенность, по­зволяющая отличить «привыкшие» и опухолевые клетки от обыч­ных каллусных. Обычно ни опухолевые, ни «привыкшие» ткани не способны к нормальной регенерации. Они могут образовывать уродливые органоподобные структуры, так называемые тератомы. В отдельных случаях у длительно культивируемых тканей удается отодвинуть порог «привыкания» благодаря изменению состава питательных сред и добиться регенерации нормального растения.

МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ ТКАНЯХ КАК ПРОЯВЛЕНИЕ ТОТИПОТЕНТНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Дифференцировка каллусных тканей. Одна из наиболее инте­ресных, но сложных проблем в биологии — развитие многокле­точных организмов. Изучение данного вопроса возможно несколькими путями. Так, большое распространение получило моделиро­вание процессов онтогенеза на более простых системах. При этом используют изолированные ткани, клетки, протопласты, культи­вируемые в стерильных условиях. Преимущество этого процесса состоит в том, что нет необходимости постоянно учитывать ре­зультаты взаимодействия органов в целостной системе раститель­ного организма. Кроме того, экспериментатор сам имеет возмож­ность выбирать, изменять и повторять условия опыта в соответ­ствии с поставленной задачей. После завершения дедифференцировки дальнейшее развитие каллусной клетки может идти в не­скольких направлениях. Во-первых, это вторичная дифференци­ровка разной степени сложности. Во-вторых, в клетке может сфор­мироваться состояние стойкой дедифференцировки («привыка­ние»), а следовательно, способность расти на безгормональной среде. В-третьих, каллусная клетка проходит свой цикл развития, завершающийся ее старением и отмиранием.

Наибольший интерес вызывает первый путь, фактически пред­ставляющий морфогенные процессы. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных струк­тур из неорганизованной массы клеток.

Вторичная дифференцировка каллусной клетки может завер­шиться образованием в каллусной ткани отдельных дифференци­рованных клеток. Они имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибластов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты. Это наиболее простой тип дифференцировки каллусной клетки. Более сложная гистологическая дифференцировка завершается образо­ванием в каллусе различных тканей: млечников, волокон, три­хом, элементов ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (сито­видные трубки и клетки-спутницы). К самым сложным видам вто­ричной дифференцировки относятся органогенез — образование органов и соматический эмбриогенез — образование из сомати­ческих клеток эмбриоидов, биполярных зародышеподобных струк­тур. Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря тотипотентности: любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была выделена. Потенциальные возможности всех клеток этого рас­тения одинаковы; каждая из них в определенных условиях может дать начало целому организму. Однако выяснено, что реально де­терминируется только одна из 400—1000 клеток, что, вероятно, связано с физиологическим состоянием клетки, с ее компетент­ностью. Так, у эксплантов стеблевого происхождения компетент­ны к действию экзогенных фитогормонов и, следовательно, спо­собны к морфогенезу только клетки эпидермальных и субэпидермальных тканей (Тран Тан Ван, 1981). Однако компетентность клеток может приобретаться ими в процессе культивирования каллусной ткани, в условиях, индуцирующих морфогенез. Время, в течение которого в каллусных клетках возникает это свойство, изменяется в широких пределах. Кроме того, существенную роль в дифференциации играют генотип растения-донора, условия и физические факторы культивирования.

Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, т. е. детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки — «клетки-инициали»— образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них ха­рактерно более крупное ядро, большее количество запасных ве­ществ, меньшие размеры вакуолей. В «клетках-инициалях» начи­нается синтез определенных белков, интенсифицируется пентозофосфатный путь расщепления гексоз. Очень важно, что между этими клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутству­ют в массе каллусных клеток.

Интересное предположение было высказано Л. Саксом и С. Тойвоненом (1963). Оно сводится к тому, что существует минималь­ная масса каллусных клеток, которая определяет способность уже детерминированных клеток к дальнейшему морфогенезу. Это под­твердилось в опытах с культурой семядолей ели: детерминация адвентивных побегов происходила в клеточных комплексах из 5 — 6 клеток (Б. С. Флинн и др., 1988). В исследованиях С.Номура и А. Комамине (1989) было показано, что развитие соматических зародышей детерминируется в 6— 10-клеточном агрегате.

Гистогенез. Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по влиянию апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовы­ваться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при на­несении на каллус ауксина с сахарозой. Интересно, что повыше­ние концентрации сахарозы способствовало образованию элемен­тов флоэмы, а понижение — образованию ксилемных элементов. Причем такое действие оказывала совместно с ауксином только сахароза, что позволяет говорить о ее регуляторной роли. Добав­ление к гормону других Сахаров гистогенеза не вызывало. В неко­торых случаях стимуляторами гистогенеза помимо ауксинов могут быть и остальные фитогормоны. Так, было отмечено, что в кал­лусных тканях сои этот процесс начинается под действием гиббе-релловой кислоты и этилена.

Органогенез. Первые работы Ф.Скуга и С.Миллера по влия­нию ауксинов и открытого ими кинетина на органогенез в каллу­сах растений показали прямую зависимость этого процесса от со­отношения фитогормонов. Преобладание концентрации ауксина над цитокинином вызывает дифференцировку клеток, приводящую к образованию корневой системы. В этом случае регенерации целого растения не происходит. При увеличении концентрации цитокинина и уменьшении ауксина начинаются стеблевой орга­ногенез и образование побега. Если его пересадить на свежую пи­тательную среду с преобладанием ауксина, то наблюдается обра­зование корней и регенерация целого растения. В настоящее время доказано, что для прохождения органогенеза очень большое зна­чение имеют принадлежность растения-донора к классу двудоль­ных или однодольных, его генотип, а также тип экспланта. Кроме того, морфогенез можно получить только при условии подбора оптимальной питательной среды, определенных физических фак­торов, балансе фитогормонов, присутствии сигнальных белков и белков-акцепторов в клетках.

Среди компонентов, входящих в состав питательных сред, важ­ную роль играют ионы NH₄ + и NO₃

. Присутствие аммонийного азота важно для начала морфогенеза, а добавление нитратного азота способствует росту и развитию образовавшихся структур. Фитогормоны, используемые для стимуляции органогенеза, не ограничиваются теперь только ауксинами и цитокининами. С этой целью в питательную среду вводят другие классы фитогормонов: абсцизины, гиббереллины, этилен.

Влияние типа экспланта на морфогенез было четко показано в работах Н. П. Аксеновой, Т. В. Бавриной, Т. Н. Константиновой. Они установили, что только экспланты, выделенные из верхних меж­доузлий, могут образовывать каллус, способный к флоральному морфогенезу. Каллусы, полученные на эксплантах из нижних меж­доузлий, давали начало только вегетативным органам.

Вопрос о механизме запуска вторичной дифференцировки у каллусных клеток остается открытым. В настоящее время самое раннее событие, связанное с морфогенезом, — это появление тканеспецифичных белков. Установлено, что все морфогенетические измене­ния активируются и (или) контролируются специальными генами.

Соматический эмбриогенез. При соматическом эмбриогенезе клетка-инициаль дает начало зиготе. Регенерант, образующийся из соматического зародыша, полностью сформирован, что устраня­ет лишние затраты по укоренению полученных при органогенезе побегов. Кроме того, соматические эмбриоиды точнее воспроизво­дят генотип исходного растения по сравнению с растениями-регенерантами, полученными в результате органогенеза. Соматические зародыши представляют и чисто практический интерес, так как могут быть использованы для получения искусственных семян.

Соматический эмбриогенез очень важен для фундаментальных наук. Он позволяет изучать механизмы эмбриогенеза, так как по­чти все его фазы, за исключением первой, в растении и в культу­ре тканей совпадают. Наиболее ранняя из изученных фаз детерми­нации клетки по эмбриональному пути развития состоит в приобретении ею свойств полярности. Так, при определении плотно­сти биоэлектрического потенциала для четырех морфогенных кле­ток оказалось, что максимальная плотность электрического тока была на полярных полюсах этой группы клеток. Переход клеток в следующую фазу эмбриогенеза сопровождался значительным по­вышением плотности тока. Предполагается, что морфогенные клет­ки могут поддерживать полярность за счет активного базипетального транспорта эндогенного ауксина, градиента биоэлектричес­ких потенциалов, градиента ионов кальция.

В связи с этим особый интерес представляют работы Ю. Б.Дол­гих (1994), в которых было установлено, что слабый постоянный электрический ток (2 мкА) может быть индуктором эмбриогенеза. Соматический эмбриогенез фактически не зависит от экзогенных фитогормонов, только развитие сформировавшихся соматических зародышей начинается в отсутствие ауксинов в среде. Однако со­держание эндогенных фитогормонов имеет решающее значение для индукции эмбриогенеза.

На регуляцию морфогенеза существенно влияет качество света. Показано (Л. Коппель, 1992), что морфогенный каллус образует­ся чаще на синем свету, чем на белом или красном. Изменения на уровне индивидуальных белков во время реализации морфогенетической программы в культуре тканей позволили говорить о су­ществовании белков развития. Однако отсутствие специфических тестов на эти белки не позволяет их выявить. Вместе с тем при использовании гибридов, продуцирующих моноклональные антитела на мембранные белки соматических зародышей, удалось выявить полипептид с молекулярной массой 45 кДа, который встречается в ядре нескольких видов растений и возможно уча­ствует в регуляции клеточного деления (Г.Смит и др., 1988). В настоящее время большое внимание уделяется генетическому ас­пекту морфогенеза, изучению соматического эмбриогенеза как генетически наследуемого признака. Роль основного двигателя процесса развития отводится дифференциальной активности ге­нов. Предполагается, что гены, контролирующие соматический эмбриогенез, начинают экспрессироваться в критические перио­ды развития эмбриоидов (Н.А.Моисеева, 1991).

ИЗОЛИРОВАННЫЕ ПРОТОПЛАСТЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Впервые термин «изолированные протопласты» был предложен Д. Ханстейном в 1880 г. Протопласт в целой клетке можно наблю­дать во время плазмолиза. Изолированный протопласт — это содер­жимое растительной клетки, окруженное плазмалеммой. Целлю­лозная стенка у данного образования отсутствует. Изолированные протопласты — одни из наиболее ценных объектов в биотехноло­гии. Они позволяют исследовать различные свойства мембран, а также транспорт веществ через плазмалемму. Главное их преиму­щество состоит в том, что в изолированные протопласты достаточ­но легко вводить генетическую информацию из органелл и клеток других растений, прокариотических организмов и из клеток жи­вотных. Е. Коккинг установил, что изолированный протопласт бла­годаря механизму пиноцитоза способен поглощать из окружающей среды не только низкомолекулярные вещества, но и крупные моле­кулы, частицы (вирусы) и даже изолированные органеллы.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче­ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гиб­ридные клетки. Таким способом можно добиться получения гиб­ридов от растений с разной степенью таксономической удален­ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза во время механического повреждения ткани. Поэтому этот метод назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое ко­личество протопластов (выделение возможно не из всех видов тка­ней); сам метод длительный и трудоемкий. Современный метод вы­деления протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разруше­ния: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного.

Первое успешное выделение протопластов из клеток высших растений данным методом сделано Е. Коккингом в 1960 г. По срав­нению с механическим ферментативный метод имеет ряд пре­имуществ. Он позволяет сравнительно легко и быстро выделять большое количество протопластов, причем они не испытывают сильного осмотического шока. После действия ферментов смесь протопластов пропускают через фильтр и центрифугируют для уда­ления неразрушенных клеток и их осколков.

Выделить протопласты можно из клеток растительных тканей, культуры каллусов и суспензионной культуры. Оптимальные усло­вия для изоляции протопластов для разных объектов индивидуаль­ны, что требует кропотливой предварительной работы по подбору концентраций ферментов, их соотношения, времени обработки. Очень важным фактором, позволяющим выделять целые жизне­способные протопласты, является подбор осмотического стабилиза­тора. В качестве стабилизаторов обычно используют различные сахара, иногда ионные осмотики (растворы солей СаС1₂, Na₂HPO₄, КС1). Концентрация осмотиков должна быть немного гипертонична, что­бы протопласты находились в состоянии слабого плазмолиза. В этом случае тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.

Изолированные протопласты можно культивировать. Обычно для этого используют те же среды, на которых растут изолирован­ные клетки и ткани. Сразу же после удаления ферментов у прото­пластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолиро­ванная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов со­пряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбрио­генез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией пос­ледовательного образования корней и побегов (органогенез) до­бились регенерации растений табака, петунии и некоторых дру­гих растений. Следует отметить, что протопласты, изолированные из генетически стабильной клеточной культуры, чаще регенери­руют растения и с большим успехом используются при исследо­ваниях генетической модификации протопластов.

Источник