Способы получения гамма глобулинов

Научная электронная библиотека

Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,

Глава 7. ВЫДЕЛЕНИЕ ГАММА-ГЛОБУЛИНА

Широкое практическое применение в настоящее время имеет метод очистки, сводящийся к выделению гамма-глобулиновой фракции иммунных сывороток. Наиболее детально этот метод изучен применительно к получению так называемого «коревого» гамма-глобулина из человеческой крови:
В последние годы интенсивно изучаются методы выделения гамма-глобулина из гипериммунных сывороток против клещевого энцефалита, бешенства, лептоспироза, сибирской язвы. Обнадеживающие результаты получены при выделении гамма-глобулина из некоторых антитоксических сывороток.
Принцип метода сводится к фракционированию сывороток спиртоводными осадителями при разных значениях рН и при температуре ниже нуля. Целью фракционирования является отделение иммунного гамма-глобулина от альбумина, альфа- и бета-глобулинов. Очистка проходит в три стадии.
1 стадия. Условия: концентрация спирта 25 %, Т °С 5 °С, рН 6,8-7,2
В осадок выпадает гамма-глобулиновая фракция; кроме того, он содержит значительные примеси, главным образом, бета-глобулина. Раствор, содержащий альбумины, а также часть альфа- и бета-глобулинов после отделения осадка путем фильтрации или центрифугирования выбрасывают. Осадок растворяют в солевом растворе
(0,01 М — NаС1), после чего осуществляется вторая стадия очистки.
2 стадия. Условия: концентрация спирта 13-17 %, Т °С -3. -6 °С, рН 5,1.
В осадок выпадает бета-глобулин, липоидные вещества и небольшое количество альфа- и гамма-глобулинов. После отделения осадка раствор, содержащий очищенный гамма-глобулин, подвергается дальнейшей обработке.
3 стадия. Условия: концентрация спирта 25-26 %, Т °С 5. 6,5 °С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл.
В осадок выпадает гамма-глобулин.
Для лучшей очистки гамма-глобулина допускается переосаждение белковых осадков, полученных на 1-й и 3-й стадиях очистки. Повторным извлечением гамма-глобулина из балластных белков после 2-го осаждения достигается повышение выхода.
Конечный выход гамма-глобулина составляет 8-10 % от общего белка сыворотки. Для удаления спирта и получения в сухом виде осадок подвергается сублимационному высушиванию.
Сухой гамма-глобулин до растворения может сохраняться в вакуум-эксикаторе над хлористым кальцием или иным поглотителем влаги не долее одного месяца.
Дальнейшей обработке может подвергаться и сырой осадок, максимально освобожденный от спирта путем суперцентрифугирования и отстаивания в течение 12-18 часов при температуре -5 °С.
При изготовлении жидкого гамма-глобулина осадок растворяется в физиологическом растворе или дистиллированной воде (если растворяется сухой осадок, в котором содержится NаС1) так, чтобы довести количество белка до 10-10,5 %. Содержание NаС1 в растворе должно быть доведено до 0,85 %. В качестве консерванта к препарату добавляется мертиолят в конечной концентрации 1:15000.
В 10 %-м растворе гамма-глобулина устанавливается рН 7,0-7,5 и с помощью рефрактометра точно проверяется количество белка. После этого раствор подвергается стерилизующей фильтрации при температуре 2-8 °С.
Разливка в ампулы производится после проверки-стерильности. Готовый препарат должен быть прозрачным или слегка опалесцирующим и содержать 10 % белка. Каждая серия контролируется методом электрофореза. Выпуск препарата допускается в том случае, если гамма-глобулиновая фракция составляет 97 % от количества общего белка.
Содержание спирта в готовом препарате в тех случаях, если обработке подвергался сырой осадок, не должно превышать 4,5 %. Каждая серия профильтрованного гамма-глобулина подвергается контролю на стерильность и безвредность. Отличие от контроля безвредности сывороток заключается в количестве вводимого препарата (свинке вводится 1 доза гамма-глобулина) и длительности срока наблюдения (за мышами наблюдают 4 дня). Годным признается препарат, не вызывающий общих и местных реакций в течение периода наблюдения.
Препараты гамма-глобулина должны сохраняться при температуре 4-10 °С. Срок годности их полтора года; по истечении этого срока, если препарат не изменил своих физических свойств, он может применяться в течение еще одного месяца.
Применение сывороточных препаратов
Сыворотки и гамма-глобулины применяются с профилактическими и лечебными целями. И в том и в другом случаях важно, чтобы антитела быстро проникали в кровь. В связи с этим препараты эти вводят внутримышечно, откуда они быстро всасываются. Применяемое раньше внутривенное введение теперь не практикуется из-за возможных при этом способе введения шоковых реакций. Известно, что сывороточные препараты, содержащие чужеродный для человеческого организма белок, вызывают сенсибилизацию его; при повторных введениях препарата, аналогичного происхождения это приводит к развитию нежелательных реакций повышенной чувствительности.
Очищенные от балластных белков сыворотки в значительной степени, но не совсем, освобождаются от сенсибилизирующих свойств. В связи с этим как нативные, так и очищенные сывороточные препараты должны вводиться с соблюдением определенных правил предосторожности. В настоящее время все иммунные сыворотки снабжаются разведенной (1:100) очищенной лошадиной сывороткой, разлитой в отдельные ампулы по 1 мл. Эта сыворотка предназначена только для выявления состояния повышенной чувствительности у детей и взрослых к белку лошадиной сыворотки. Для лечения и профилактики инфекционных болезней она не применяется.
Разведенную сыворотку употребляют непосредственно перед введением лечебной или профилактической дозы всех видов антитоксических сывороток с целью предупреждения анафилактических реакций. Сыворотка вводится внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья в объеме 0,1 мл. Наблюдение за реакцией ведется в течение 20 минут.
Если диаметр папулы за это время не превышает 0,9 см и вокруг нее отмечается ограниченная гиперемия, реакция считается отрицательной. В таком случае иммунную сыворотку вводят подкожно, сначала в количестве 0,1 мл, если реакция отсутствует — через 30 мин — 1 час всю остальную.
При положительной реакции на разведенную сыворотку, введенную внутрикожно, папула увеличивается в диаметре до 1-3 и более сантиметров и окружена большой зоной гиперемии. В этом случае, если имеются безусловные показания к введению сыворотки, это делают с особыми предосторожностями. Сначала вводят под кожу разведенную сыворотку в дозах 0,5-2,0-5,0 мл с интервалами 15-20 минут. Если реакция отсутствует, то вводят неразведенную сыворотку, сначала 0,1 мл, а затем через 30 минут, при отсутствии реакции, — всю остальную.
Если в ответ на введение малых доз возникает реакция, рекомендуется вводить сыворотку под наркозом (гексоналовым, пентоталовым и др.).
Усложнение приемов серотерапии и профилактики оправдывается стремлением предохранить организм от осложнений, связанных с повышенной чувствительностью к чужеродному белку в тех случаях, когда это не может послужить поводом к отмене введения сыворотки (дифтерия, столбняк, ботулизм, клещевой энцефалит и др.).
При появлении анафилактических реакций больному вводят адреналин, эфедрин, новокаин, хлористый кальций, глюкозу, гормональные препараты и сердечные средства в дозах, указанных в специальных наставлениях, которыми снабжается каждая коробка с сывороточными препаратами.
В этом разделе необходимо остановиться на перспективах использования гамма-глобулина, выделенного из человеческой крови. До недавних пор он, применялся, гласным образом, для профилактики кори. Однако его применение для предупреждения других болезней, показало несомненную ценность. Это обусловлено содержанием в нем антител против соответствующих возбудителей (коклюша, оспы, по-видимому, эпидемического гепатита). Выпускается же гамма-глобулин без указания титра, антител, за исключением титра гриппозных антител в гамма-глобулине, полученном из крови иммунизированных гриппозной вакциной доноров. По-видимому, в ближайшее время будут указываться титры и других антител. Возможно, что расширится приготовление гамма-глобулинов из крови иммунизированных разными антигенами доноров. Таким образом человеческий гамма-глобулин перестанет быть только «коревым» и распространит свое влияние на другие области инфекционной патологии.

Источник

Белковые фракции, общий белок

Что такое белковые фракции (Serum Protein Electrophoresis, SPE)?

Общий белок сыворотки крови состоит из смеси белков с разной структурой и функциями. Разделение на фракции основано на разной подвижности белков под действием электрического поля. Обычно методом электрофореза выделяют несколько стандартных фракций:

• альбумины;
• альфа1-глобулины;
• альфа2-глобулины;
• бета-глобулины;
• гамма-глобулины;
• бета-1-глобулины;
• бета-2-глобулины.

Фракция альбуминов в норме составляет 40-60% от общего количества белка. Альбумин – основной белок плазмы крови. Альбумин плазмы быстро обновляется. В течение суток синтезируется и распадается 10-16 г белка этой фракции. Синтез альбумина происходит в печени, зависит от доступа аминокислот и, следовательно, скорость синтеза снижается в период белковой недостаточности.

Основные функции альбумина:

поддержание коллоидно-осмотического (онкотического) давления плазмы и объема циркулирующей крови;

транспортная функция: связываясь с билирубином, холестерином, желчными кислотами, ионами металлов (в частности с кальцием), гормонами (тироксином, трийодтиронином, кортизолом, альдостероном), свободными жирными кислотами и лекарствами, поступающими в организм извне (антибиотиками, салицилатами). Таким образом альбумин участвует в минеральном, пигментном, гормональном и некоторых других видах обмена, регулируя содержание свободных (не связанных с белком фракций) биологически важных веществ, обладающих более высокой активностью. Благодаря этой функции, альбумин играет значительную роль в осуществлении процессов детоксикации организма.

Фракция альфа1-глобулина включает в себя острофазные белки:

• альфа1-антитрипсин (основной компонент этой фракции) — ингибитор многих протеолитических ферментов — трипсина, химотрипсина, плазмина и.т.д.;
• альфа1-кислый гликопротеин (орозомукоид) — обладает широким спектром функций, в зоне воспаления способствует фибриллогенезу.

К глобулинам относятся транспортные белки:

тироксинсвязывающий глобулин, транкортин — связывает и транспортирует кортизол и тироксин соответственно;

альфа1-липопротеин (ЛПВП) — участвует в транспорте липидов.

Фракция альфа2-глобулинов преимущественно включает острофазные белки:

• альфа2-макроглобулин — участвует в развитии инфекционных и воспалительных реакций;
• гаптоглобин — образует комплекс с гемоглобином, высвобождающимся из эритроцитов при внутрисосудистом гемолизе, утилизирующийся затем клетками ретикулоэндотелиальной системы;
• церулоплазмин — специфически связывает ионы меди, а также является оксидазой аскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина (ДОФА), способен инактивировать свободные радикалы
• аполипопротеин В.

Альфа-липопротеиды участвуют в транспорте липидов.

Фракция бета-глобулинов содержит:

• трансферрин — переносит железо;
• гемопексин — связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа;
• компоненты комплемента — участвуют в реакциях иммунитета;
• бета-липопротеиды — участвуют в транспорте холестерина и фосфолипидов;
• часть иммуноглобулинов.

Фракция гамма-глобулинов состоит из:

• иммуноглобулинов (в порядке количественного убывания — IgG, IgA, IgM, IgE) — обеспечивают гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ.
• При многих заболеваниях встречается нарушение соотношения фракций белков плазмы (диспротеинемия). Диспротеинемии наблюдаются чаще, чем изменение общего количества белка и при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, эффективность проводимых лечебных мероприятий.

Показания к назначению анализа:

• острые и хронические воспалительные заболевания (инфекции, коллагенозы);
• онкологические заболевания;
• нарушения питания и синдром мальабсорбции.

Когда значения повышены?

Альбумин:

Фракция альфа1- глобулина(повышение альфа1-антитрипсина):

• патология паренхимы печени;
• острые и хронические воспалительные процессы (инфекции и ревматические заболевания);
• опухоли;
• травма и хирургические вмешательства;
• беременность (3 триместр);
• прием андрогенов;

Фракция альфа2-глобулина:

повышение альфа2-макроглобулина (нефротический синдром, гепатит, цирроз печени, прием эстрогенов и оральных контрацептивов , хронический воспалительный процесс, беременность);

повышение гаптоглобина (воспаление, злокачественные опухоли, некроз тканей).

Фракция бета-глобулина:

• первичные и вторичные гиперлипопротеинемии;
• моноклональные гаммапатии;
• прием эстрогенов, железодефицитная анемия (повышение трансферрина);
• беременность;
• механическая желтуха;
• миелома (IgA-тип).

Фракция гамма-глобулина:

• хроническая патология печени(хронический активный гепатит, цирроз);
• хронические инфекции, саркоидоз, паразитарные инвазии;
• аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, системная красная волчанка);
• лимфопролиферативные заболевания (миелома, лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема).

Когда значения понижены?

Альбумин:

• нарушения питания;
• синдром мальабсорбции;
• болезни печени и почек;
• опухоли;
• коллагенозы;
• ожоги;
• гипергидратация;
• кровотечения;
• анальбуминемия;
• беременность.

Фракция альфа1- глобулина(повышение альфа1-антитрипсина):

• наследственный дефицит альфа1 -антитрипсина;
• болезнь Tangier.

Фракция альфа2-глобулина:

• снижение альфа2-макроглобулина (панкреатит, ожоги, травмы);
• снижение гаптоглобина (гемолиз различной этиологии, панкреатит, саркоидоз).
• Фракция бета-глобулина:
• гипо-b-липопротеинемии;
• гефицит IgA.

Фракция гамма-глобулина:

• иммунодефицитные состояния;
• прием глюкокортикоидов;
• плазмаферез;
• беременность.

Источник