Способы подсчета количества эритроцитов
Работа 3. Определение количества форменных элементов крови
Подсчет форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) является существенным компонентом лабораторно-клинического анализа. Эритроциты (красные кровяные клетки) принимают участие в газообмене. Лейкоциты (белые кровяные клетки) защищают организм от инородных частиц и микроорганизмов, являются частью иммунной системы. Тромбоциты (кровяные пластинки) участвуют в процессе свертывания крови.
Для подсчета форменных элементов взятую кровь разбавляют в специальных смесителях (меланжерах), чтобы создать нужную концентрацию клеток. Для подсчета используют счетную камеру Горяева (описание дано ниже). Количественное содержание форменных элементов крови отражается в гемограмме и в системе СИ, рассчитывается на 1 л крови.
Цель работы – овладеть методами определения содержания эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в исследуемой крови.
Для работы необходимы: микроскоп; счетная камера Горяева; меланжеры для эритроцитов и лейкоцитов; скарификатор; 2 чашечки для разбавляющих жидкостей; вата,
3%-ный раствор хлорида натрия, 5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синью; 1%-ный раствор бриллиант-крезиволого синего, спирт.
Объект исследования – человек.
Ход работы . Перед началом работы необходимо разобраться в устройстве счетной камеры Горяева. Для этого следует поместить камеру под микроскоп и сначала под малым, а затем под большим увеличением рассмотреть сетку камеры, найти малые и большие квадраты (рис. 1). Счетная камера Горяева (рис. 1, 2) представляет собой толстое предметное стекло, в средней части которого имеются четыре желобка. Между ними образуются узкие площадки. Средняя площадка ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от него расположены сетки, нанесенные на стекло. При наложении на боковые площадки покровного стекла над сеткой образуется камера глубиной 0,1 мм. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов. Каждый третий квадрат разделен на 16 маленьких квадратов. Таких больших квадратов, разделенных на маленькие, в сетке 25. Сторона маленького квадрата равняется 1/20 мм, площадь – 1/400 мм 2 , а объем пространства над маленьким квадратом равен 1/400 мм 2 × 1/10 мм = 1/4000 мм 3 . Внешний вид камеры Горяева и счетной сетки следует зарисовать, обозначив большие и малые квадраты.
Смеситель для разбавления крови (рис. 1) представляет собой капилляр с ампулообразным расширением. В ампуле находится стеклянная бусинка для лучшего размешивания крови. На капилляре смесителя нанесены две метки: «0,5» и «1,0»; третья метка стоит за ампулообразным расширением: на смесителе для эритроцитов – «101», для лейкоцитов – «11». Если в смеситель для эритроцитов набирают кровь до метки «1, 0», а затем наливают разбавляющую жидкость, доводя общий объем до «101», кровь разводится в 100 раз. При разведении в 200 раз кровь следует набирать в смеситель до метки «0,5». Для разбавления крови при подсчете эритроцитов применяют гипертонический раствор NaCl (3 %), в котором эритроциты сморщиваются.
Рис. 1. Камера Горяева (1, 2), сетка камеры Горяева (3), смеситель для взятия крови (4)
В смесителе для лейкоцитов получают разбавление крови в 10 и 20 раз. При подсчете лейкоцитов применяют 5%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовой синью. Кислота разрушает оболочки эритроцитов и лейкоцитов, а метиленовая синь окрашивает ядра последних. При этом эритроциты становятся невидимыми и не мешают подсчету лейкоцитов.
Задача 1. Определение количества эритроцитов
У человека в норме в 1 мкл содержится 4,5–5 млн эритроцитов (или 4,5–5 × 10 12 в 1 л). Во всей крови человека содержится 25 трлн красных кровяных телец. За сутки образуется и разрушается примерно 200–250 млрд эритроцитов. Эритроциты человека – безъядерные клетки, имеющие форму двояковогнутых дисков. Развиваются эритроциты в красном костном мозге. Срок жизни эритроцитов равен в среднем 120 дней. Лишение ядра привело к тому, что эритроцит потребляет в 200 раз меньше кислорода, чем его ядерные предшественники (эритробласты и нормобласты). Основной частью эритроцитов является гемоглобин, который обеспечивает дыхательную функцию крови. Разрушение эритроцитов происходит в печени и селезенке, в органах, которые называют «кладбищем эритроцитов». Еще один путь разрушения эритроцитов – гемолиз. Он происходит потому, что при старении эритроциты становятся сферичнее и гемолизируются прямо в циркулирующую кровь. Гемолиз эритроцитов in vitro сопровождается выходом гемоглобина в плазму крови, которая окрашивается при этом в красный цвет и становится прозрачной (лаковая кровь). Количество эритроцитов изменчиво. Увеличение их числа называют эритроцитозом (эритремией), а уменьшение – эритропенией (анемией). Абсолютный эритроцитоз наблюдается при низком парциальном давлении кислорода (на высокогорье), у больных с хроническими заболеваниями легких и сердца вследствие гипоксии, которая стимулирует эритропоэз. Абсолютная эритропения развивается вследствие пониженного образования эритроцитов, усиленного разрушения или после кровопотери.
Ход работы. Камеру Горяева накрывают покровным стеклом, притирая его края к стеклу камеры до появления радужных колец. Оставив камеру под микроскопом, забирают кровь из пальца у человека смесителем для эритроцитов. После прокола первую каплю крови из пальца стирают ватным тампоном, во вторую каплю погружают кончик смесителя для эритроцитов, держат его вертикально и набирают кровь до отметки 0,5. В капилляр не должны попасть пузырьки воздуха. Затем обтирают кончик капилляра фильтровальной бумагой и быстро, пока кровь не свернулась, переносят в чашку с 3 % раствором хлористого натрия. Набирают раствор до отметки 101 (т. е. кровь разводят в 200 раз) и переводят смеситель в горизонтальное положение, оставляют на столе.
Перед процедурой определения эритроцитов берут заполненный меланжер и, зажав нижний конец пальцем, снимают резиновую грушу. Затем, зажав оба конца меланжера III и I пальцами в течение 1 мин, перемешивают кровь. Первые три капли крови из смесителя выпускают наружу, а последующую каплю наносят на среднюю площадку камеры Горяева у края покровного стекла. Благодаря капиллярным силам капля втягивается под покровное стекло и заполняет камеру. Равномерное распределение эритроцитов является показателем хорошего перемешивания крови.
Считать эритроциты удобнее при объективе малого увеличения (х8), но использовать при этом окуляр ×40.
Подсчитываем число эритроцитов в 5 больших квадратах, расположенных в различных местах сетки, например по диагонали. Находим среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадрате. Для этого полученное число эритроцитов (Э) делим на 80 (в 1 большом квадрате находится 16 маленьких: 5 × 16 = 80). Объем пространства над одним маленьким квадратом равен 1/4000 мм 3 . Умножая полученное число на 4000, получаем количество эритроцитов в 1 мм 3 разведенной крови; умножая на 200 (число разбавления), получаем количество эритроцитов в 1 мм 3 цельной крови. Итоговая формула для вычисления эритроцитов в 1 мм 3 следующая:
Э= А х 4000 х 200 80 =А × 10000 
,
где А – найденная сумма эритроцитов в 5 больших (80 маленьких) квадратах.
Результаты работы и их оформление. Зарисовать в рабочую тетрадь камеру Горяева, указать число эритроцитов в 1 мм 3 (мкл), а также в 1 л исследованной крови. Сравнить полученные результаты с нормой
Задача 2. Определение числа ретикулоцитов
Ретикулоциты – это молодые формы эритроцитов. Ретикулоциты образуются на стадии полихроматофильного нормобласта путем выталкивания ядра. В отличие от зрелых эритроцитов, в цитоплазме ретикулоцитов содержатся сетевидные включения, которые выявляются при окрашивании специальной краской. По своей величине ретикулоцит крупнее эритроцита-нормоцита. В норме в крови содержится от 6 до 15 ретикулоцитов на 1000 эритроцитов.
Количество ретикулоцитов в крови является показателем интенсивности эритропоэза. Ретикулоцитоз – показатель активации эритропоэза.
Ход работы. На предметное стекло следует нанести каплю 1 % раствора бриллиант-крезилового синего. После прокола пальца к появившейся капле крови прикасаются покровным стеклом. Плотно прижав покровное стекло к предметному, делают мазок, распределив кровь между стеклами очень тонким слоем. Зернистое содержимое ретикулоцитов окрашивается в синий цвет. Мазок крови рассматривают под микроскопом с иммерсионным увеличением и ограниченным полем зрения. Подсчитывают количество эритроцитов и отмечают найденные среди них ретикулоциты. Результат выражают в процентах.
Результаты работы и их оформление. Воспроизведите в рабочем журнале последовательные стадии эритропоэза, укажите количество ретикулоцитов в процентах по отношению к общему количеству эритроцитов. В выводе следует указать, соответствует ли полученное число ретикулоцитов норме.
Задача 3. Определение лейкоцитов
Лейкоциты (белые кровяные клетки) играют важную роль в защите организма от микробов, вирусов, патогенных простейших, т. е. они обеспечивают иммунитет. У человека в норме кровь содержит 4–9 10 9 /л лейкоцитов (в 500–1000 раз меньше, чем эритроцитов). Увеличение их количества называют лейкоцитозом, а уменьшение – лейкопенией. Лейкоциты, в отличие от эритроцитов, содержат ядро. Лейкоциты неоднородны, включают гранулоциты (зернистые) и агранулоциты (незернистые). В группу гранулоцитов входят нейтрофилы (50–75 %), эозинофилы (1–5 %) и базофилы
(0–1 %). Названия гранулоцитов связаны с различными красителями (нейтральными, кислыми и щелочными), способными окрашивать гранулы лейкоцитов. Агранулоциты включают лимфоциты (20–40 %) и моноциты (2–10 %).
Ход работы. Подсчет лейкоцитов (Л) производят в камере Горяева в 25 больших квадратах (400 маленьких). После освобождения первых трех капель крови из смесителя для лейкоцитов последующую каплю наносят на среднюю площадку камеры Горяева у края покровного стекла. Благодаря капиллярным силам капля втягивается под покровное стекло и заполняет камеру. Равномерное распределение лейкоцитов свидетельствует о хорошем перемешивании крови.
Подсчет лейкоцитов производят в 25 больших квадратах (400 малых квадратов).
Итоговая формула для подсчета лейкоцитов в 1 мм 3 с учетом разбавления в 20 раз следующая:
Л= В х 4000 х 20 400 =В × 200 
,
где В – сумма лейкоцитов в 25 больших (400 маленьких) квадратах.
Результаты работы и их оформление. Занесите в рабочую тетрадь результаты подсчета лейкоцитов, установите их соответствие норме.
Задача 4. Подсчет тромбоцитов
Тромбоциты играют важную роль в гемостазе, в них присутствует много специфических соединений (тромбоцитарных факторов), участвующих в свертывании крови. Тромбоциты бесцветные двояковыпуклые образования, их в 2–8 раз меньше эритроцитов. В крови здоровых людей содержится 200–400·10 9 /л тромбоцитов (200–400 тыс. в 1 мкл). Они образуются в костном мозге из мегакариоцитов. Из одной такой клетки формируется 3–4 тыс. кровяных пластинок. Продолжительность жизни тромбоцитов 8–12 суток. Днем тромбоцитов больше, чем ночью. Число тромбоцитов изменяется при эмоциях, физической нагрузке, после еды.
Ход работы. Для подсчета тромбоцитов используется специальный раствор для разбавления крови. На 100 мл дистиллированной воды берут 3,8 г цитрата натрия, 0,57 г хлорида натрия, 0,15 г метиленовой сини. Раствор кипятят, фильтруют, затем в него добавляют 2–3 капли крепкого формалина.
Кровь набирают в меланжер для эритроцитов до метки 0, 5 и тотчас разбавляют раствором до метки 101 (разбавление в 200 раз). После 10–15 мин стояния крови в меланжере тромбоциты окрашиваются метиленовой синью.
Подсчет тромбоцитов ведут под большим увеличением. При правильном соблюдении условий тромбоциты распределяются по камере равномерно между эритроцитами и имеют вид голубоватых глыбок. Подсчитывают их число в 25 больших квадратах и вычисляют концентрацию тромбоцитов в 1 мм 3 (1 мкл) крови по формуле:
Х = С · 4000 · 200/400,
где С – число тромбоцитов в 25 больших квадратах, составляющих 400 маленьких квадратиков.
Результаты работы и их оформление. Занесите в рабочую тетрадь результаты подсчета тромбоцитов, сделайте соответствующие выводы.
Источник
Способы подсчета количества эритроцитов
Принцип прямого счисления заключается в следующем: разбавить кровь в пипетке Potain (предусмотренной красным шариком для эритроцитов и белым — для лейкоцитов и тромбоцитов), при этом разбавляющая жидкость разная, соответственно виду клеток.
К разбавляющим жидкостям относятся:
а) для эритроцитов:
— хлорид натрия —1 г.
— сульфат натрия — 5 г.
— сублимат — 0,5 г.
— дистилированная вода — 200 мл.
б) для лейкоцитов:
— ледяная укусусная кислота — 2 мл.
— 1% метиленблау — 1 капля
— дистилированная вода — до 100 мл.
в) для тромбоцитов: — щавелевокислый аммоний — 1 г.
— Nа2ЭДТА — 0,01 г.
— дистилированная вода — 100 мл.
Пипетки Potain должны быть чистыми, совершенно сухими и цельными. До потребления пипетку испытать на проницаемость путем вдувания воздуха, после использования ее следует промыть проточной водой, с помощью трубки для вакуума, затем дистилированной водой. Через несколько дневные интервалы держать пипетку по 24 часа в серохроми-стой смеси, затем промывать тщательно проточной и дистилированной водой.
Высушивать в сушильном шкафу, при температуре 180°. Когда требуется срочное высушивание, пипетку промывать спиртом, а затем эфиром.
Разжижение крови. Набрать в пипетку кровь до деления 0,5, затем разбавляющую жидкость до деления 101 — в пипетку с красным шариком (для счисления эритроцитов) и до деления 11 в пипетку с белым шариком (для счисления лейкоцитов и тромбоцитов). Получаются следующие растворы: 1/200 для эритроцитов и 1/20 для лейкоцитов и тромбоцитов.
Счисление проводится в камере Бюркер-Тюрк или Горяева, к которой хорошо прикреплена чистая оригинальная пластинка.
Заполнение камеры для счисления. В течение 2 мин. хорошо встряхивать пипетку, затем отбросив первые 2—3 капли налить в камеру для счисления, на край пластинки, небольшое количество смеси, которое заполнит пространство в силу капиллярности. Нежелателен избыток смеси, поскольку он заполняет канавки гемоцитометра. Подождать выпадение форменных элементов крови (1—2 мин. в случае эритроцитов и лейкоцитов, 10—15 мин. во влажной камере — для тромбоцитов).
Счисление эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Исследование проводить обычным оптическим устройством (объективом 10 х для лейкоцитов и 20 х или 40 х для эритроцитов и тромбоцитов, при этом конденсор располагается в среднем положении). Счисление проводить на следующих площадях;
— для эритроцитов — 5 квадратов (1/25 квадратиков по 1/400), т.е. 1/5 мм 2 ;
— для лейкоцитов — 4 квадрата, расположенные по углам камеры Бюркер-Тюрк, т.е. 4 мм 2 ;
— для тромбоцитов — одинаково с эритроцитами.
Из клеточных элементов, расположенных по линиям, отграничивающим площади счисления, подсчитывать лишь те из них, которые находятся вдоль одной вертикальной отграничивающей линии (напр. левой) и одной горизонтальной (напр. верхней).
Расчет эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. В целях определения числа форменных элементов на мм 2 учитывать площадь, вышину, разведение:
№ эритроцитов/мм 3 = № насчитанных эритроцитов х 5 х 10 х х 200 = № эритроцитов х 10 000;
№ лейкоцитов/мм 3 = № насчитанных лейкоцитов х 10 х 20 : 4 = = № насчитанных лейкоцитов х 50;
№ тромбоцитов/мм 3 = № насчитанных тромбоцитов х 5 х 10 х х 20 = число насчитанных тромбоцитов х 1000.
Отбор крови для подсчета тромбоцитов можно проводить также пипеткой Potain для эритроцитов, в таком случае отсасывать кровь до деления 1 а разбавляющую жидкость до деления 101. Получится разведение 1/100. Тромбоциты счислять с 200 квадратиков (1/2 мм2), полученную цифру умножить на 2000.
Поправка числа лейкоцитов в случае эритробластоза. Когда в крови находятся эритробласты число ядерных элементов, полученных при счислении, откоррегировать соответственно результату лейкоцитной формулы, по формуле: № лейкоцитов/мм3 = № ядерных элементов/мм3 х 100 / (100 + № эритробластов/100 лейкоцитов).
Количественное определение кровяных клеток основывается на их счислении на небольшом, предполагаемым однородным образце и обобщением результата на всю массу крови организма. Между полученным результатом и фактическим значением может возникнуть разница (погрешность), которая подвергается математическому расчету для определения степени точности каждого метода в отдельности.
Отклонения от строгого соблюдения технических указаний создают многочисленные причины погрешностей на протяжении всего процесса производимых в камере подсчетов. В том числе:
а) погрешности отбора,
б) ошибки аппаратуры,
в) техники,
г) неоднородного распределения в счислительной камере.
Когда проба отбирается одной пипеткой а счисление производится в одной камере погрешность определения числа эритроцитов составляет ±30%, лейкоцитов +20%, а тромбоцитов +30—40%. В то время как в отношении лейкоцитов и тромбоцитов такая погрешность незначительна, поскольку она меньше биологических колебаний, в отношении эритроцитов точность техники представляется неудовлетворительной.
В целях максимального снижения погрешности — и повышения точности счислений попимо строгого соблюдения технических указаний, пробы следует отбирать в 2 пипетки, а счисление проводить в 2 гемоцитометрах. В таких условиях наименьшая погрешность для эритроцитов уменьшается до +11%, для лейкоцитов и тромбоцитов до +16%. Однако электронное счисление представляет значительно большую степень точности. Так в отношении эритроцитов погрешность составляет +3%, для лейкоцитов+4%, а в отношении тромбоцитов +7,5%.
Тем не менее, счисление эритроцитов в камере остается наиболее сложный и в то же время наименее точный метод, причины, по которой его нельзя рассматривать как метод отбора. Единственным показанием к счислению эритроцитов является определение вида анемии.
При счислении тромбоцитов, независимо от метода, для проверки точности результата делается сопоставление с аспектом тромбоцитов на мазке крови.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Источник
