Способы определения резус принадлежности крови

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делятся на способы, применяемые в клинике: в условиях приемного покоя, в операционной, на отделении у постели больного и т. д., не требующие специального лабораторного оснащения, и лабораторные способы.

Способы определения резус-фактора в клинике. Используются два так называемых экспресс-метода: экспресс-метод со стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева. Экспресс-метод на плоскости без подогрева.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ (IV), содержащую 33% раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают но ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса «антиген — антитело» и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывании пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности.

Лабораторные методы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод конглютинации с желатином

В пробирку помещают равные объемы исследуемых эритроцитов, антирезусной сыворотки и 10% раствора желатина. Пробирки инкубируют при температуре 45-48є C, после чего добавляют десятикратный объем физиологического раствора. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат по наличию агглютинации, видимой невооруженным глазом.

Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Эта реакция является наиболее чувствительной для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки (АГС). При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус- положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь — резус-отрицательная.

Реакция с aнти-D-моноклональными антителами.

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстрое наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная — агглютинация отсутствует.

Источник

Определение резус-фактора экспресс-методом

Приводим пошаговое описание методики определения резус-фактора экспресс-методом с помощью универсального реагента антирезус Rh₀(D), содержащего неполные поликлональные IgG анти-D антитела, в пробирке без подогрева. Публикуем подробное руководство по постановке реакции конглютинации с желатином с применением стандартного реагента Rh₀(D) или цоликлона Анти-D. Доказываем преимущества использования цоликлонов Анти-D-супер и Анти-D по сравнению с универсальным реагентом.

В состав стандартного универсального реагента антирезус Rh₀(D) входят поликлональные неполные IgG анти-D антитела. Для подтверждения достоверности определения резус-фактора крови донора экспресс-методом необходимо провести проверку контрольных образцов стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. При проведении контрольного исследования используйте тест-эритроциты Rh+ группы 0 или совпадающей по системе AB0 группы и одногруппные по AB0 тест-эритроциты Rh-.

Методика постановки реакции в пробирке без подогрева

1. Внесите на дно пробирки одну каплю реагента антирезус Rh₀(D).

2. Добавьте к содержимому пробирки одну каплю анализируемых эритроцитов.

3. Встряхните пробирку для перемешивания жидкостей.

4. Наклоните пробирку практически до горизонтального положения и с небольшой скоростью поворачивайте вокруг вертикальной оси не менее трех минут. Рассредоточение эритроцитов по стенкам способствует более выраженным результатам реакции.

5. Добавьте 2 – 3 мл изотонического раствора NaCl и 2 – 3 раза переверните пробирку без взбалтывания. Хлорид натрия исключает проявление неспецифической агглютинации.

6. Оцените результат реакции визуально. Выраженные агглютинаты на фоне прозрачной жидкости говорят о наличии антигена D, равномерно окрашенная жидкость без агрегации эритроцитов – свидетельство резус-отрицательной крови.

Постановка реакции конглютинации с желатином

Реакция проходит с использованием стандартного реагента антирезус Rh₀(D) или цоликлона Анти-D.

1. Внесите в пробирку приблизительно 0,05 мл (одну каплю) анализируемой крови или 50 % взвеси эритроцитов в сыворотке.

2. Подогрейте 10 % раствор желатина до жидкого состояния.

3. Добавьте к исследуемому образцу крови 0,1 мл (две капли) желатина.

4. Внесите 0,1 мл (две капли) реагента антирезус Rh₀(D) или цоликлона Анти-D.

5. Перемешайте содержимое.

6. Подогрейте пробирку в водяной бане при 37 °C в течение 10 минут.

7. Долейте 5 – 8 мл раствора NaCl.

8. Перемешайте жидкости, осторожно перевернув пробирку 1 – 2 раза.

9. Проведите оценку результата реакции невооруженным глазом, допускается использование лупы.

Явно выраженные агрегаты различного размера на фоне прозрачного раствора свидетельствуют об обнаружении антигена D, равномерно окрашенная жидкость без наличия агглютинатов – признак отсутствия агглютиногена.

10. Подтвердите достоверность исследования контрольным определением.

При неадекватных результатах контрольного исследования повторите определение резус-фактора экспресс-методом с заменой типирующего реагента и/или желатина. В случае мелкозернистой агглютинации проведите дополнительное исследование эритроцитов в непрямой реакции Кумбса.

Сравнение различных методов определения резус-фактора

С целью выбора оптимального метода типирования крови специалисты в области трансфузиологии провели сравнительную оценку эффективности применения цоликлонов Анти-D-супер, Анти-D двух разных серий и универсального реагента антирезус Rh₀(D) для определения резус-фактора экспресс-методом в пробирке без подогрева (Шевченко, Ю.Л. Безопасное переливание крови/Ю.Л. Шевченко, Е.Б. Жибурт. — СПб.: Питер, 2000. — 308 с.). При сравнении методов анализа учитывали такие критерии, как скорость и специфичность реакции, выраженность агглютинации, выявление слабых форм антигена D u .

При проведении сравнения анализировали 3778 образцов крови доноров. При первичном определении выявили 418 (11,1 %) резус-отрицательных образцов, из которых на втором этапе исследования 42 (1,1 %) образца отнесли к резус-положительным ввиду обнаружения фенотипа D-C+.

При сравнении анализа на наличие антигена D с использованием Анти-D-супер и Rh₀(D) выявили значительные преимущества применения цоликлона Анти-D-супер: высокую скорость наступления реакции, выраженный характер агглютинации, возможность проведения исследования на плоскости. Результаты сравнения методов приведены в Таблице № 1.

Таблица № 1. Сравнения результатов типирования крови доноров с помощью цоликлона Анти-D-супер и универсального реагента антирезус Rh₀(D).

Параметр сравнения	Цоликлон Анти-D-супер	Универсальный реагент антирезус Rh0(D)
Скорость реакции	8 – 10 секунд	3 – 4 минуты
Выраженность агглютинации (от + до ++++)	++++	+++ и ++++
Специфичность	да	да

418 резус-отрицательных образцов крови доноров дополнительно анализировали на наличие антигена D с помощью универсального реагента Rh₀(D) в пробирке без подогрева и цоликлона Анти-D в желатиновом тесте. По итогам второго этапа исследования, в трех образцах эритроцитов (0,08 %) выявили слабый антиген D u . Цоликлон Анти-D продемонстрировал более высокую достоверность обнаружения слабых форм антигена D ввиду абсолютной специфичности и высокого титра (1:512) антител класса IgG по сравнению с универсальным реагентом антирезус Rh₀(D), использование которого основано на усилении действия неполных антител полиглюкином, что может вызывать неспецифическую агглютинацию и затруднить трактовку результатов реакции.

Источник

Определение группы крови и резус принадлежности

Крайне важное значение для клинической практики имеет определение антигенов эритроцитов – идентификация группы крови и резус-фактора. Группа крови человека определяется наличием на поверхности эритроцита антигенов и является индивидуальным признаком. Эритроцитарные поверхностные антигены эритроцитов определяет фенотип эритроцитов или группу крови человека.

В настоящее время известно более 200 антигенов эритроцитов, поэтому группа крови может отличаться в зависимости от количества используемых антисывороток для идентификации антигенов на поверхности эритроцитов. Эритроцитарные антигены, идентифицированные в популяции в 1% случаев, считаются редкими.

Основной системой идентификации групп крови является система АВО, в которой группа крови характеризуется наличием на поверхности эритроцитов антигенов А, В, АВ или их отсутствием (О), т.е. четыре группы крови. В некоторых руководствах встречается дополнительная маркировка групп крови: О (I); А(II); В (III) и АВ (IV).

Выявление в 1901 г. эритроцитарных антигенов положило начало изучению допустимости смешивания эритроцитов разных групп, т.е. совместимости гемотрансфузий. В крови (сыворотке) каждого индивидуума циркулируют антитела (называемые так же агглютинины), активные в отношении чужеродных антигенов. Взаимодействие антиген-антитело приводит к агглютинации (слипанию) и разрушению эритроцитов. В крови индивидуумов с группой крови А циркулируют антитела против антигенов В. Индивидуумы с группой крови В имеют антитела, против антигенов А. При группе крови О в сыворотке определяются антитела анти-А, анти-В, тогда как при группе крови АВ ни антитела А, ни антитела В в сыворотке не определяются.

Таким образом, индивидуумы с группой крови АВ являются универсальными реципиентами иногрупной крови.

Индивидуумы с группой крови О, эритроциты которых не имеют на поверхности ни А, ни В антигенов, являются универсальными донорами.

Антитела к эритроцитарным антигенам А или В являются генетически детерминированными, в соответствии с группой крови эритроцитов, тогда как антитела к другим поверхностным антигенам эритроцитов являются приобретенными. Пациенты, получающие трансфузии, со временем накапливают антитела, что может осложнять подбор требуемой группы крови. Для таких пациентов важно выполнять типирование группы крови с оценкой возможно большего спектра антител сыворотки.

Группа крови оценка совместимости

Для оценки совместимости групп крови и возможности трансфузий необходимо исследование реакции антител сыворотки донора и эритроцитов реципиента, а также эритроцитов донора и антител сыворотки реципиента.

При совместимости групп крови смешивание эритроцитов и сыворотки не приводит к изменению состава и окраски реакционной капли.

При несовместимости групп смешивание эритроцитов донора и сыворотки пациента вызывает реакцию агглютинации – образование в капле неоднородностей в виде слипшихся эритроцитов, точечно насыщающих поле реакции.

Резус-фактором (Rh) называют антиген D, который может располагаться на поверхности эритроцитов. Наличие или отсутствие этого антигена на поверхности эритроцитов индивидуума определяет такую характеристику группы крови, как резус положительная или резус отрицательная (Rh+ или Rh–). Примерно 85% популяции людей имеют резус-положительную группу крови (Rh+).

В отличие от антител к антигенам АВ, антитела к антигену D не присутствуют в крови. При контакте крови резус-положительной группы с резус-отрицательной, происходит сенсибилизация и синтез анти-резусных антител. Такая реакция развивается, например, при беременности Rh– матери Rh+ плодом. Выход фетальных клеток во время родов в кровоток матери активизирует синтез антирезусных антител. В случае пересечения антирезусными антителами плацентарного барьера и попадания в кровь плода, развивается гемолитическая желтуха новорожденного, обусловленная разрушением эритроцитов.

Определение резус фактора необходимо для каждого индивидуума в дополнение к определению группы крови. Отмечено, что выраженность структуры эритроцитарного антигена различна у здоровых людей и тем более у иммуноскомпроментированных больных, беременных женщин.

В настоящее время определение групп крови, резус фактора, продукции антиэритроцитарных антител выполняется в автоматическом режиме стандартизированными методами, позволяющими одномоментно проводить как типирование групп крови, определение продукции антител, так и совместимости возможных трансфузий. Визуальное отображение полученной карты для каждого пациента может быть востребовано в течение всей жизни пациента, она хранится в базе данных лаборатории.

Показания к исследованию: Любое стационарное лечение, беременность.

Условия взятия и хранения образца

Для исследования используется венозную кровь, взятую с ЭДТА или без консервантов. Взятие крови производится натощак, или не менее чем через 8 ч после последнего приема пищи. Образец крови может храниться при температуре от 4–8 °С не более 24 ч.

Группа крови системы АВО:

• 0 (I) – первая группа;
• A (II) – вторая группа;
• B (III) – третья группа;
• AB (IV) – четвертая группа крови.

При выявлении подтипов (слабых вариантов) групповых антигенов результат выдается с соответствующим комментарием, например, «выявлен ослабленный вариант А2, необходим индивидуальный подбор компонентов крови».

• Rh (+) положительная;
• Rh (–) отрицательная.

При выявлении слабых и вариантных подтипов антигена D выдается комментарий: «выявлен слабый резус-антиген, рекомендуется при необходимости выполнять трансфузию резус-отрицательных компонентов крови».

Источник