Способы определения мутации генома человека методом пцр

ПЦР-диагностика

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

Источник

X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2018

МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ ПАТОЛОГИЙ

Каждый вид микроорганизмов, растений или животных имеет уникальный набор хромосом. Они образованы ДНК – дезоксирибонуклеиновой кислотой. Мелкие фрагменты ДНК называются нуклеотидами, а их определенная последовательность составляет ген. Каждый ген кодирует синтез одного белка. Последовательность нуклеотидов уникальна. Для каждого вида живых организмов существуют общие участки ДНК, отвечающие за однообразие в пределах этого вида.

Анализ ДНК нескольких сотен микробов, попавших в материал для исследования, не позволит выявить видовые закономерности. Необходимо во много раз увеличить количество значимых генетических компонентов, что даст возможность их идентифицировать. Эту задачу решает метод ПЦР.

Современные высокотехнологичные методы лабораторного исследования позволяют определить болезни на начальной стадии. Инфекционные заболевания развиваются и эволюционируют, их становится все больше, а выявить их все сложнее. Диагностика методом ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одной из самых новейших и высокоточных. Большинство врачей сталкиваются с этим анализом ежедневно и уже не представляют, как без него возможно поставить правильный диагноз и стадию болезни. За ее разработку ученый Кэри Мюллис был награжден Нобелевской премией.

Цель: изучить основу метода ПЦР-диагностики, применение метода, его преимущества и недостатки, ход исследования.

Задачи:

1)Понять суть метода ПЦР-диагностики;

2)Изучить ход исследования,

3)Рассмотреть плюсы и минусы метода;

4)Определить области применения ПЦР исследования.

Полимеразная цепная реакция – метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий найти у людей разные виды инфекционных и наследственных патологий, как в острой и хронической форме, так и задолго до того, как патология начинает себя проявлять.

При проведении анализа ПЦР используются специальные ферменты, многократно копирующие фрагменты РНК и ДНК, а также микроорганизмы, возбуждающие заболевания и находящиеся в биологических материалах человека. Копирование происходит в несколько этапов, поэтому образуется цепная реакция. После этого специалисты лаборатории делают сверку полученных данных с общей базой и выявляют возбудителей заболевания, а также их концентрацию. Диагностику проводят в специальном приборе, который производит охлаждение и нагревание пробирки с биоматериалом и называется амплификатор. Соблюдение температурного режима влияет на правдивость результатов анализа.

Фрагменты ДНК микроорганизмов могут содержаться в следующих биологических материалах:

кровь и ее производные;

соскоб эпителиальных клеток или мазок;

слизь и другие биологические выделения;

биопаты слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР

Диагностика инфекционных заболеваний с применением полимеразной цепной реакции велика, с ее помощью можно определить самые разнообразные вирусы, вызывающие такие инфекции как:

-ВИЧ – ПЦР-диагностика ВИЧ очень эффективна для обнаружения вируса, который вызывают эту болезнь, блокирует защитные функции и открывает путь в организм человека всевозможным патологиям;

-герпес – диагностика герпеса методом ПЦР может обнаружить вирус у человека только во время рецидива, этот способ позволяет установить какого он типа;

-мочеполовые инфекции – ПЦР-диагностика урогенитальных инфекций (хламидиоз, уреаплазмоз, гарднереллез, микоплазмоз, трихомониаз, кандидоз и прочие) на сегодняшний день активно применяется, так как определить возбудителей ИППП с помощью традиционных анализов сложно, а диагностика инфекций методом ПЦР позволяет в минимальной пробе выявить наличие патогенных микроорганизмов и вовремя начать терапию;

-гепатит – диагностика гепатита методом ПЦР является одним из важнейших шагов для определения причин его появления и назначения адекватной схемы лечения, без использования современных молекулярно-биологических методов поставить адекватный диагноз данной патологии невозможно;

-листериоз – ПЦР-диагностика позволяет выявить даже единичных возбудителей данного заболевания в кратчайшие сроки;

-цитомегаловирус – ПЦР-диагностика этого заболевания считается прогрессивной, но не дает возможность определить является ли инфекция первичной или повторной, другими словами не различает активный вирус от спящего;

туберкулез – ПЦР-диагностика туберкулеза помогает выявить наличие активной формы патологии в несколько раз оперативнее, чем другие исследования, также можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями на фоне кажущейся стабилизации состояния больного. Для диагностики туберкулеза у детей делают пробу Манту, если она положительная, то метод ПЦР позволяет с высокой точностью подтвердить установленный диагноз и определить не только туберкулез легких, но и поражение этим вирусом кожи, почек, кишечника и других органов;

-вирус папилломы человека – ПЦР-диагностика ВПЧ используется для определения его типа и помогает определить количественные и качественные характеристики вируса;

-клещевой энцефалит – результаты ПЦР при определении хронической формы заболевания являются самыми надежными;

-глистная инвазия – диагностика паразитов помогает выявить инвазии простейшими, а также внутриклеточными паразитами, но он не позволяет определить степень тяжести заражения и количество вредителей в организме;

-хеликобактерная инфекция – с помощью метода ПЦР возможно определение высокопатогенных и низкопатогенных штампов Хеликобактер Пилори, это важно для прогноза заболевания и эффективной терапии.

Беременным женщинам назначают анализ ПЦРК, чтобы выявить инфекции, передающиеся половым путем, значительно увеличивающие риск появления рака шейки матки, пагубно влияющие на протекание беременности и здоровье ребенка. Поэтому крайне важна диагностика ЗППП, чтобы не допустить заражение плода патогенными микроорганизмами.

Процесс анализа состоит из нескольких фаз, каждая из которых требует определенного времени и температурного режима. В течение нескольких часов из тысячной доли грамма ДНК бактерий получается нужное количество материала для анализа. Современная аппаратура дает возможность многократно копировать ДНК даже одной клетки, например, сперматозоида.

взятие биологического материала (крови, мочи, влагалищных выделений, слюны и так далее) у пациента и доставка в лабораторию;

разделение двух нитей ДНК, переплетение которых образует хромосому, и очищение их от посторонних примесей;

удвоение нужного участка нити ДНК, в результате ее количество растет в геометрической прогрессии;

обработка полученного материала растворами, вызывающими специфическое свечение полученных фрагментов ДНК, по этому окрашиванию распознают, какая бактерия или вирус были в источнике; для разделения фракций ДНК используют электрофорез.

Длительность анализа составляет 4-5 часов.

Подготовка к исследованию

Для достоверности результатов необходимо соблюдать правила по предварительной подготовке к анализу:

при сдаче слюны нельзя кушать и пить медикаменты за четыре часа до анализа, перед процедурой надо промыть рот кипяченой водой, после этого провести небольшой массаж кожи для того, чтобы выделился секрет из железы;

мочу как правило собирают дома. Перед этим необходимо помыть половые органы и собрать в специальный контейнер 50 мл первой утренней мочи, нецелесообразно собирать материал при менструации;

перед сдачей спермы мужчине нужно трое суток не вступать от половую связь, не посещать сауну, не купаться в горячей ванне, не принимать алкогольные напитки и острую еду. Непосредственно перед анализом запрещено мочиться три часа;

для сдачи урогенитального мазка рекомендовано отсутствие половых связей на протяжении трех суток. За две недели до анализа запрещен прием антибактериальных лекарств. За неделю надо перестать пользоваться интимными гелями, мазями, влагалищными свечами, не делать спринцевание. Три часа до взятия биоматериала необходимо воздерживаться от похода в туалет.

кровь сдается в утреннее время на голодный желудок.

ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ АНАЛИЗА ПЦР

Полимеразная цепная реакция обладает такими преимуществами перед традиционными способами определения возбудителей инфекции:

-большая чувствительность теста позволяет определить даже единичные агенты возбудителя, что дает возможность выявить патологию на ранней стадии, при хронической и скрытой форме;

-универсальность метода позволяет использовать почти любой биоматериал для исследования от слюны до клеток кожи;

-большой охват – при исследовании одного образца возможно определить наличие нескольких разных возбудителей заболеваний;

-точность – высокий уровень этого метода обследования позволяет не выдавать ложных показателей;

-скорость – результат готов в среднем за пять часов, то есть пациент на другой день после сдачи биоматериала уже может забрать заключение;

-относительно невысокая цена – данный метод диагностики по стоимости не отличается от других лабораторных анализов крови;

-используя этот метод, можно сделать доклиническую и ретроспективную диагностику. Первая выявляет патогенные микроорганизмы еще до проявления заболевания, а вторая проводится после перенесенной патологии, что позволяет не дать патологии развиться и вовремя ее вылечить, а также определить латентную форму заболевания, протекающую без явных симптомов.

Минусы ПЦР связаны в основном с ее технической сложностью:

-необходимо правильно выбрать последовательности РНК – праймеры, а также приготовить смесь нуклеотидов для синтеза ДНК;

-метод очень чувствителен, поэтому если в образце есть разные виды микробов, он может давать неверные результаты;

-нужно тщательно очищать анализируемый материал от примесей белков человека и лекарств, так как они снижают точность диагностики;

-требуется контрольное сравнение результатов с образцами, заведомо содержащими или не содержащими материал микроорганизмов, а также вообще не включающими ДНК для определения ошибок и загрязнений.

Ложноотрицательные результаты ПЦР вызваны нарушением техники анализа и изменениями в генетической последовательности любого из компонентов реакции. Встречаются и ложноположительные данные – при случайном совпадении нуклеотидов праймеров и других применяемых реактивов с одним из генов микроорганизма

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Можно сделать вывод, что лабораторная диагностика с применением метода ПЦР помогает врачу установить точный диагноз и назначить эффективную терапию в каждом индивидуальном случае. Перспективы применения ПЦР-реакции и ее разновидностей в медицине и биологии захватывают воображение – от испытания новых лекарств на генном уровне до создания трансгенных организмов с заданными свойствами. Работы в этом направлении ведутся в крупнейших лабораториях мира, что помогает совершенствовать метод ПЦР и на прикладном уровне, для диагностики инфекционных болезней человека.

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с.,

Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.;

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т.

Источник