Способы определения чувствительности бактерий

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА

Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru

Содержание

Резюме

В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.

В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.

Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре и результатах контролируемых клинических исследований

Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.

Этиотропное назначение антибиотиков основано на выделении возбудителя инфекции из очага инфекции и определении его чувствительности к антибиотикам

Вторая причина, обусловливающая необходимость определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам — это получение эпидемиологических данных о структуре резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций. В практике эти данные используют при эмпирическом назначении антибиотиков, а также для формирования больничных формуляров.

Методы определения чувствительности к антибиотикам

Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам: диффузионные методы с использованием дисков с антибиотиками с помощью Е-тестов методы разведения разведение в жидкой питательной среде (бульоне) разведение в агаре

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35 о -37 о С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. 1).

Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35 о -37 о С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

Интерпретация результатов определения чувствительности

На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).

Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.

Пограничные концентрации не являются неизменными величинами. Они могут пересматриваться, в зависимости от изменения чувствительности популяции микроорганизмов. Разработкой и пересмотром критериев интерпретации занимаются ведущие специалисты (химиотерапевты и микробиологи), входящие в специальные комитеты. Одним из них является Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США (National Committee for Clinical Laboratory Standards — NCCLS). В настоящее время стандарты NCCLS признаны в мире и используются как международные для оценки результатов определения чувствительности бактерий при многоцентровых микробиологических и клинических исследованиях.

Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.

Чувствительные микроорганизмы (susceptible)

Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.

При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).

Резистентные микроорганизмы (resistant)

К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.

Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)

Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.

С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.

Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.

В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — это наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определенного периода времени

Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.

В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.

Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий

Источник

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

• Вы здесь:
• Библиотека технолога
• Пиво и напитки
• Г.С. Качмазов — Дрожжи бродильных производств

17. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ

К ним относят метод диффузии в агар и метод серийных разведений (на жидкой и плотной питатель­ных средах).

Для посева используют суточные чистые культуры выделенных микроорганизмов. При отсутствии возмож­ности получения чистой культуры можно использовать дрожжевую взвесь или производственный субстрат, содер­жащие всю микрофлору в исследуемом материале.

При исследовании материала, содержащего дрожже­вые клетки, в остывшие до
45–50°С питательные среды вносят нистатин и тщательно перемешивают.

17.1. МЕТОД ДИФФУЗИИ В АГАР (МЕТОД БУМАЖНЫХ ДИСКОВ)

Наиболее простой в исполнении метод, однако его нельзя считать количественным.

В качестве основы питательной среды целесообразно применять производственное агаризованное (2,5%) сусло с содержанием 120–140 мг% аминного азота. Питатель­ную среду разливают в чашки Петри слоем 4–5 мм. Перед посевом чашки со средой досушивают в термостате или в стерильном боксе.

Диски с антибиотиками (диаметр 5–6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск содержит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпа­ют силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении силикагель меняет окра­ску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для исполь­зования не пригодны. Флаконы с дисками хранят при температуре 4–20°С.

0,5 см 3 исследуемого материала наносят на агар и шпа­телем Дригальского тщательно распределяют по поверх­ности питательной среды до полного впитывания. Затем на поверх­ность среды стерильным пинцетом накладыва­ют, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на расстоянии 2–2,5 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37°С в течение 24–48 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким обра­зом вокруг диска зону отсутствия роста. Ближе к диску концен­трация антибиотика в агаре выше, по мере удале­ния от диска концентрация снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задержки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорга­низмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки рос­та микроорганизмов вокруг диска указывает на устойчи­вость исследуемой культуры к данному антибиотику.

При зоне отсутствия роста до 10 мм культура счита­ется устойчивой, от 10 до 15 мм говорят о малой чувстви­тельности к антибиотику, от 15 до 25 мм – о достаточ­ной чувствительности, свыше 25 мм – о высокой чувст­вительности.

17.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

Для проведения опыта готовят основные рас­творы антибиотиков. Готовятся они с та­ким расчетом, что­бы в первой пробирке концентрация антибиотика соста­вила 100 ЕД/см 3 .

На этикетке ампулы или флакона указана концентра­ция антибиотика в ЕД/см 3 или мкг/см 3 . Навески бензил-пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина три­гид­рата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15 М фосфатном буфере (ка­лия фосфат однозамещенный – 3,63 г, натрия фосфат двузаме­щенный – 7,13 г, вода дистиллированная – до 1000 см3). Основные растворы тетрацик­линовых антибио­тиков готовят на 0,01 Н растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно—, канамицина используют дистиллированную воду.

Если на этикетке препарата дозировка указана в весо­вых единицах, следует иметь в виду, что для большей час­ти антибиотиков 1 г активного вещества соответствует 1 000 000 ЕД. Из этого расчета и следует разводить анти­биотик.

Если порошок антибиотика, расфасован немерно и на этикетке указано количество единиц активности в 1 мг, необходимо к точной навеске препарата, сделанной на аналитических весах, добавить равный объем раствори­теля, т. е. получить раствор мг/см 3 , в 1 см 3 которого со­держится столько единиц, сколько их было указано на этикетке. Из этого основного раствора делают дальней­шие разведения.

Для определения чувствительности микробов к суль­фаниламидам может быть применен любой из указанных методов, причем во внимание принимается только степень разведения навески препарата.

17.2.1. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ В ЖИДКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

На основе стерильного производственного сусла гото­вится серия 2-кратных серийных разведений исследуемо­го антибиотика. Первая пробирка содержит 100 ЕД/см 3 антибиотика, каждая последующая – в два раза мень­ше. Засевная доза исследуемой суточной бактериальной культуры составляет 10% от общего объема питательной среды.

Питательную среду разливают по 4,5 см 3 в пробирки, расставленные в штативы по 10 в каждом ряду. Готовят основной раствор антибиотика и добавляют 4,5 см 3 этого раствора в первую пробирку. После тщательного перемешивания новой стерильной мерной пипеткой переносят 4,5 см 3 из этой пробирки в следующую и т. д. до девятой пробирки, из которой 4,5 см 3 выливают. Десятая пробир­ка, не содержащая антибиотика, служит контролем роста культуры.

Для постановки этого опыта используют имеющиеся в продаже препараты, на этикетке которых указано количе­ство единиц во флаконе. Например, если флакон содержит 500 000 ЕД пенициллина, то, добавив в него 10 см 3 дистил­лированной воды, получают раствор, содержащий в 1 см 3 50 000 ЕД, при дальнейшем разведении в 100 раз получа­ют раствор с концентрацией пенициллина 500 ЕД/см 3 . Для получения требуемой концентра­ции антибиотика даль­нейшие разведения целесообразнее делать с использова­нием стерильной питательной среды.

Чистые агаровые или бульонные культуры микроор­ганизмов предварительно разводят физиологическим рас­твором до концентрации клеток 5·10 6 клеток/см 3 в соот­ветствии со стандартом мутности.

Агаровую культуру испытуемого микроба смывают изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную взвесь по 1,0 см 3 вносят во все пробирки ряда, начиная с контроль­ной.

Результаты регистрируют после инкубации при 37°С в течение 24–48 ч. Последняя пробирка с прозрачным бульоном, при наличии густого роста в контроле, опреде­ляет минимальную, подавляющую рост данного микро­организма концентрацию антибиотика.

Учет результатов: наименьшее количество антибиоти­ка, дающее визуально полную задержку роста (среда про­зрачная), соответствует минимальной подавляющей кон­центрации препарата (МПК или МБсК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют вы­севом на плотные питательные среды из последних про­зрачных пробирок, которые предварительно встряхива­ют. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, со­держимое которой после инкубирования в течение 24–72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принимают за МБцК.

17.2.2. МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ НА ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ

Для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или 2,5%-ный агар на основе производственного сусла с со­держанием аминного азота 120–140 мг/см 3 . Приготовлен­ный основной раствор антибиотиков разво­дят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлаж­денному до 55°С агару, разлитому в широкие пробирки по 18 см 3 , добавляют по 2 см 3 соответствующего разведения определенного антибиотика, тщательно перемешивают и переливают в сте­рильную чашку Петри. После застывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Контроль­ные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засева­ют исследуемой культурой. Посев делают бакте­риологиче­ской петлей из микробной суспензии с концентрацией кле­ток 10 6 –10 7 клеток/см 3 . Чашки помещают в термостат при 37°С на 24–48 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при кото­рой наблюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост единичных колоний, принимают за МПК препа­рата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, считают, что исследуе­мые концентрации антибиотиков превышают МПК пре­парата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем концентра­циям антибиотика.

Общую чувствительность к сульфаниламидам, как и к антибиотикам, можно определить методом канавки. На агаре в чашке Петри по ее диаметру прорезают канавку, в которую вносят определенное разведение изучаемого пре­парата. Перпендикулярно к канавке засевают штрихом изучаемые культуры микроорганизмов. После инкубации при 37°С 24–48 ч отмечают наличие участков задержки роста микроорганизмов, если послед­ние чувствительны к данному препарату.

Источник