Способы окраски мазков крови

Статьи и практика

20.07		Статья «Точность оценки скорости движения сперматозоидов».

При самых различных заболеваниях кроветворного аппарата (лейкозы, анемии, новообразования и пр.), как правило, приходится прибегать к окраске азур-эозиновыми смесями; из них наиболее часто в патологогистологической практике применяются краска Романовского-Гимза и азур II-эозин. Оба красителя по своему составу весьма сходны и процедура окрашивания ими одинакова. Для достижения хороших результатов основным и решающим моментом является свежесть материала. Погибшие или убитые экспериментальные животные должны быть вскрыты немедленно, а трупы умерших людей — по возможности не позднее 3—6 часов после смерти. Кроме того, следует строго соблюдать и целый ряд других условий:

1.Фиксация кусочков в ценкер-формоле; допускается и жидкость Орта как вполне полноценный в данном случае фиксатор.

Можно получать неплохие результаты и после формалиновой фиксации, но при условии хромирования срезов и притом лучше в комбинации с сулемой. Декальцинированные объекты мало пригодны для гематологических исследований.

2.Срезы готовят максимально тонкие (5 мкм) и лучше всего парафиновые.

3. Для разведения красителей и промывания препаратов (срезов и мазков) берут свежую дистиллированную воду, сохраняемую под натронной известью. В день работы требуемое количество дистиллированной воды следует прокипятить в течение 3—5 минут, охладить и плотно закрыть. Оптимальный pH воды для гематологических окрасок — 6,8—7,0.

4.Посуда для красителей и дистиллированной воды должна быть безукоризненно чистой.

5.Красящие растворы готовят перед самым употреблением, нельзя допускать даже самого непродолжительного стояния их. Как во время приготовления красящего раствора, так и в момент выливания его на срезы не должно быть выпадения осадков. Образование осадков делает краску негодной и зависит либо от качества ее (что особенно надо иметь в виду в отношении краски Романовского—Гимза), либо от дистиллированной воды и, наконец, от посуды.

Приготовленную красящую смесь нельзя лишний раз взбалтывать, не допускается даже передвигать посуду, в которой идет окрашивание; и то и другое способствует преждевременному выпадению красителя.

6.Окрашивание проводят в чашках Петри на стеклянных палочках или на обломках спичек срезами вниз. Можно окрашивать и в стаканчиках.

7.Во избежание преждевременного выцветания препаратов употребляют ксилол хорошего качества (не содержащий кислоты). Из различных сортов ксилола здесь может быть рекомендован орто-ксилол, как наиболее очищенный. По своей цене он значительно дороже обычного «чистого» кислола, представляющего собой смесь трех изомеров (мета, орто, пара) с преимущественным содержанием м-ксилола.

8.Учитывая необходимость исследования с иммерсионной системой, пользуются тонкими покровными стеклами, не толще 0,17 мм.

ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ — ГИМЗА

Методика окраски. 1. Если материал был фиксирован в ценкер-формоле и осадки не были своевременно удалены в кусочках , то наклеенные на стекла срезы (депарафинированные) вначале освобождают от сулемовых осадков и после этого хорошо промывают в дистиллированной воде. Препараты помещают в чашки Петри или в стаканчики.

2. Готовят красящий раствор в градуированном цилиндре, примерно из расчета 1—2—3 капли краски Романовского—Гимза на 1 мл дистиллированной воды г. Цилиндр один раз переворачивают для размешивания раствора и краску выливают в чашки Петри на срезы. Проверяют, нет ли выпадения осадков, при неудаче готовят новую порцию краски (при этом посуду тщательно перемывают) .

3. Срезы оставляют в краске при комнатной температуре на 18-24 часа, а в термостате при 37° -на 1-2 часа.

4. Основательно промывают в водопроводной воде. Срезы должны быть резко перекрашены, темно-синего цвета.

5. Дифференцируют в воде, подкисленной уксусной кислотой (из расчета 2-3 капли крепкой или ледяной уксусной кислоты на 200 мл воды) до тех пор, пока будут отходить грубые облачка синей краски (азур) и срез порозовеет. Обесцвечивание препарата идет быстро.

6. Основательно промывают в воде и доводят дифференцировку до конца одним чистым 96° спиртом, контролируя под микроскопом, пока отчетливо выделятся различные клеточные структуры. Хорошо дифференцированные срезы — бледно-синие с сиреневым оттенком.

7. Быстро проводят через абсолютный спирт, отжимают фильтровальной бумагой, просветляют ксилолом и заключают в бальзам. Применение абсолютного спирта необязательно.

Нельзя пользоваться карбол-ксилолом, креозотом и анилиновым маслом.

Можно употреблять эвкалиптовое, бергамотное и оригановое масла, но их надо тщательно удалять ксилолом.

Краску Романовского-Гимза в готовом виде.

ОКРАСКА АЗУР II-ЭОЗИНОМ

1. Срезы подготавливают так же, как и для окраски по способу Романовского—Гимза (см. пункт 1 метода Романовского-Гимза).

2. Готовят основные растворы из азура II и эозина (раствори­мого в воде), каждый из расчета 1 г на 1000 мл дистиллированной воды. Эти растворы довольно стойки и долго сохраняются (месяцами), но обязательно в темноте.

3. Непосредственно перед употреблением основные растворы красителей разводят дистиллированной водой следующим образом: берут 12 мл раствора эозина и доливают до 90 мл дистиллированной водой, а затем приливают 10 мл раствора азура II. Осторожно покачивая посуду, перемешивают смесь, получается раствор темно- фиолетового цвета.Готовую красящую смесь выливают на срезы. Следить за осадками.

4. Окрашивают в чашках Петри (на стеклянных палочках) или стаканчиках при комнатной температуре — 18—24 часа, а в термостате при 37° — 1—2 часа.

5. Промывают в водопроводной воде и дифференцируют как при окраске по способу Романовского—Гимза (см. пункты 5 и 6 метода Романовского—Гимза).

6. Быстро проводят через абсолютный спирт (необязательно), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Методика окраски капризная. Как уже было отмечено выше, успех в основном определяется качеством дистиллированной воды, употребляемой для приготовления красящих растворов.

Ввиду возможных неудач желательно одновременно пускать в работу побольше срезов.

Готовые препараты хранят в темноте.

При хорошем качестве красителей препараты сохраняются многими годами, в противном случае они постепенно обесцвечиваются.

ОКРАСКА МАЗКОВ КРОВИ ПО РОМАНОВСКОМУ — ГИМЗА

Для приготовления мазков крови берут тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла. Каплю крови помещают на конец предметного стекла и размазывают ребром другого (шлифованного) стекла. Чтобы получить хороший мазок, узкое ребро шлифованного стекла ставят слева от капли, непосредственно соприкасаясь с ней, под углом в 45°. Выжидают, пока капля крови расплывется, и тогда легким быстрым движением справа налево размазывают каплю. Капля должна быть соответствующей вели­чины, т. е. такой, чтобы при изготовлении мазка она была пол­ностью и без остатка исчерпана. При всех манипуляциях, связанных с приготовлением мазка, предметные стекла следует держать только за ребра. Приготовленный мазок сушат, помахивая препаратом до момента исчезновения влажного блеска. Высохший мазок фиксируют в метиловом или чистом 96° спирте (в стаканчиках); в первом — 3—5 минут, во втором — 10—15 минут. По окончании фиксации препарат вынимают из спирта пинцетом, ставят вертикально на фильтровальную бумагу и ожидают испарения спирта.

1. Разводят продажную краску Романовского—Гимза из расчета 1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды и помещают в нее фиксированный мазок на 15—20— 30 минут (в зависимости от качества красителя). Окрашивают в стаканчиках или чашках Петри.

2. Основательно промывают в дистиллированной воде и просушивают фильтровальной бумагой.

Препарат исследуют с иммерсионной системой.

Можно заключать в бальзам, тогда каплю последнего кладут на хорошо высушенный мазок и покрывают покровным стеклом (не толще 0,17 мм).

базофильная зернистость лейко­цитов — темно-фиолетовая;

кровяные пластинки — лиловые;

базофильная протоплазма лимфоцитов — синеватая.

Посуда, в которой приготовляют красящий раствор и окраши­вают мазки, должна быть безукоризненно чистой. Краску готовят по мере надобности и на свежей дистиллированной воде.

Есть и другие очень хорошие способы окраски кровяных мазков, как, например, Май—Грюнвальда, Лейшмана, Паппенгейма, описание которых можно найти в различных курсах по микроско­пической технике (С. П. Шуенинов, 1916; С. С. Вайль, 1947; Ромейс, 1953, и др.). В отношении результатов окраски все они сходны между собой и с краской Ро­мановского-Гимза.

Окрашивание по Паппенгейму

Предварительная фиксация мазков не требуется. На подсохшие на воздухе мазки наливают краску-фиксатор Мая —Грюнвальда на 3 мин. Не сливая краску, к ней добавляют такое же количество дистиллированной воды. Через 1 мин краску с мазка сливают и, не ополаскивая его, наливают профильтрованный рабочий раствор (разведение 1:4) готовой краски Романовского —Гимзы (при pH 6,8) на 5 мин. После окра­шивания препараты промывают дистиллированной водой и высушива­ют на воздухе, устанавливая вертикально в специальной сушке.

Для приготовления краски-фиксатора Мая—Грюнвальда 250 мг по­рошка Мая—Грюнвальда растворяют в 100 мл метилового спирта. Раствор подогревают при 70 °С на водяной бане да полного растворения порошка, фильтруют и хранят в бутылке с притертой пробкой.

Окрашивание по Паппенгейму в модификации Н. Ю. Полонской

Готовят 0,3% раствор красителя Мая—Грюнвальда (300 мг порошка красителя растворяют в 100 мл метилового спирта; раствор созревает 3 дня), раствор азура II (1 г растворяют в 1000 мл кипящей воды), раствор эозина калия или натрия (1 г эозина калия или 0,5 г эозина натрия растворяют в 1000 мл кипящей воды).

Высушенные мазки фиксируют в метиловом спирте 3 мин. Затем окрашивают 0,3% раствором Мая — Грюнвальда, на одну часть которого добавлено четыре части фосфатного буфера (pH 6,8 —7,2), 10 мин. Докрашивают азурэозином (одна часть раствора азура на одну часть раствора эозина и 5 частей фосфатного буфера при pH 6,8 —7,2) 20 мин. Смывают краситель проточной водой. Высушивают мазки на воздухе.

Окрашивание мазков по Лейшману

Готовят краску Лейшмана (2,5 г сухого красителя на 1 л метилового спирта; краситель созревает 3 — 4 дня), азур (1 г сухого красителя на 1 л дистиллированной воды, краситель созревает 3—4 недели); эозин (1 г сухого красителя на 1 л дистиллированной воды, краситель созревает 3-недели).

Высушенный на воздухе мазок переносят на 3 мин в краситель Лейшмана, промывают в водопроводной воде.

Удаляют (стряхивают) избыток воды и заливают красителем, в состав которого входят 40 мл азура, 30 мл эозина и 70 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 30-40 мин. Промывают водопроводной водой. Высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой.

Срочное окрашивание по Алексееву

Тонкие мазки фиксируют в подогретом до 35—40 °С растворе Мая— Грюнвальда 30 с.

Ополаскивают в воде.

Окрашивают в 0,1 % растворе азур- эозина (2:1) 2 мин.

Ополаскивают в воде и высушивают, промокая.

Окрашивание по Папаниколау и его модификации

Влажный препарат фиксируют в смеси Никифорова в течение 30 мин.

Если после фиксации его залить глицерином на 2 ч, то потом препарат можно хранить до 14 дней.

Перед окрашиванием препарат проводят через спирты нисходящей концентрации (100%, 95%, 80%, 50%) и дистиллированную воду (в каждом стаканчике держат по 2 мин).

Окрашивают гематоксилином в течение 10 мин (перед использованием раствор красителя необходимо фильтровать).

Промывают в 3-х сменах дистиллированной воды.

Затем переносят в смесь из 97 мл 70 % спирта и 3 мл концентрированного раствора аммиака (препарат становится синим). В этой смеси препарат необходимо ополоснуть несколько раз.

Опускают в 70 % спирт и затем промывают в проточной воде.

Опускают в раствор карбоната лития на 1 мин (3 капли насыщенного водного раствора на 100 мл дистиллированной воды). Промывают в проточной воде 5 мин.

Обезвоживают (дистиллированной водой и спиртами восходящей концентрации — 50 %, 70 %, 80 %, 100 %).

Докрашивают в течение 4 мин в оранжевом G (готовый раствор).

Ополаскивают в двух сменах 95 % спирта.

Опускают в краситель Папаниколау на 1 — 2 мин.

Ополаскивают в трех сменах 95 % спирта и двух сменах 100 % спирта (в последней смене держат 5 мин).

Просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Красители приготавливают следующим образом.

Раствор 1: 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в 10 мл 100% спирта.

Ра­створ 2: 20 г алюмокалиевых квасцов при нагревании растворяют в 200 мл дистиллированной воды.

Через 24 ч растворы 1 и 2 смешивают и добавляют 0,5 г оксида ртути (красного), нагревают до кипения и охлаждают на водяной бане. Через 24 ч отфильтрованный раствор может быть использован. Каждый раз перед применением его следует фильтровать.

Краситель Папаниколау приготавливают следующим образом. Смешивают 45 мл 1,5 % раствора светлого зеленого (лихтгрюн) в 95 % спирте, 10 мл 0,5 % раствора основного коричневого (бисмаркбраун) в 95 % спирте, 45 мл 0,5 % раствора эозина в 85 % спирте, 0,2 г фосфорно­молибденовой кислоты и добавляют одну каплю насыщенного водного раствора карбоната лития (1 г на 100 мл дистиллированной воды).

Отечественные цитологи предлагают модификацию метода, в которой светлый зеленый заменен на более доступный бриллиантовый зеленый.

Окрашивание по Папаниколау в модификации Куницы

Оранжевый G: смешивают раствор 0,5 г оранжевого G на 100 мл 96 % спирта и 0,015 г фосфорно-молибденовой кислоты. Полученный раствор оставляют на 1 сут, после чего он годен для использования.

Чтобы приготовить промежуточный краситель и бриллиантовый зеленый, необходимо за 1 сут приготовить следующие водные растворы:

основного коричневого — 0,1 г на 1 л дистиллированной воды;

эозина (желтого или обычного) — 0,1 г на 1 л дистиллированной воды;

бриллиантового зеленого — 0,05 г на 1 мл дистиллированной воды + 1 мл 96 % спирта.

Эти растворы необходимо плотно закрыть на 1 сут в термостате при 37 °С. Далее на них готовят спиртовые растворы красителей.

Промежуточный краситель: основной коричневый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта (если эозин обычный — 1 мл водного раствора на 260 мл 96 % спирта). Для получения промежуточного красителя, представляющего собой смесь, берут следующие количества вещества на 100 мл смеси: 16 мл спиртового раствора основного коричневого, 84 мл спиртового раствора эозина (желтоватого или обычного), 0,17 г фосфорно-молибденовой кислоты и добавляют одну каплю насыщенного раствора карбоната лития.

Красители фильтруют перед смешиванием, остаток хранят непрофильтрованным.

Бриллиантовый зеленый: 0,5 мл водно-спиртового раствора на 180 мл 96 % спирта.

Препарат фиксируют в смеси Никифорова (минимальная продолжительность фиксации — 30 мин).

Промывают в 96 % спирте, а затем дистиллированной воде.

Окрашивают гематоксилином 2 — 3 мин, промывают в воде.

Дифференцируют 0,5 % раствором соляной кислоты до покраснения в течение 2 — 3 мин, сливают, промывают в воде. Контролируют под микроскопом окраску ядер.

Опускают на 1 мин в слабый раствор карбоната лития (три капли насыщенного водного раствора лития на 100 мл дистиллированной воды), промывают в воде.

Тщательно обезвоживают мазок 96 % спиртом.

Окрашивают оранжевым G в течение 1 мин, наливая краситель на стекло. Сливают краситель и хорошо промывают спиртом до удаления его избытка.

Красят промежуточным красителем 1 мин, сливают, промывают в спирте.

Окрашивают бриллиантовым зеленым 1 — 2 мин, сливают, промывают спиртом, промокают.

Проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Окрашивание по Папаниколау в модификации Руденко

Вначале готовят водные растворы цитоплазматических красок: по 0,1 г светлого зеленого, эозина желтоватого водорастворимого и основного коричневого растворяют отдельно в 1 мл воды. Водные растворы, хорошо закрыв, оставляют на 1 сут в термостате при 37 °С. Затем из водных растворов готовят спиртовые растворы красителей:

светлый зеленый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта;

эозин желтоватый водорастворимый — 1 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта;

основной коричневый — 0,25 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта.

После этого готовят смесь, которую Г. Папаниколау назвал ЕА-36. Она состоит из смеси спиртовых растворов красителей: 200 мл светлого зеленого, 168 мл эозина желтоватого и 32 мл основного коричневого, которые перед смешиванием фильтруют. К смеси добавляют 0,68 — 0,8 г фосфорно-молибденовой кислоты и четыре капли насыщенного водного раствора карбоната лития.

В растворе красителя образуется небольшое количество устойчивого осадка, не мешающего работе. Полной готовности краска достигает через 3—12 дней при комнатной температуре.

Для приготовления оранжевого G 0,5 г сухого вещества растворяют в 100 мл 96 % спирта и добавляют 0,02 — 0,05 г фосфорно-молибденовой кислоты. Полученный насыщенный раствор готов к применению на следующий день. После того как использован весь раствор красителя, в эту же посуду с осадком можно добавить 100 мл 96 % спирта и указанное количество фосфорно-молибденовой кислоты. Оставшиеся количества спиртовых растворов эозина желтоватого и основного коричневого хранят и используют для приготовления красителя 3 — 6 мес.

Мазки фиксируют в жидкости Никифорова 30 мин.

Промывают в 96 % спирте 1 мин, затем в дистиллированной воде 2 — 3 мин.

Окрашивают в растворе гематоксилина 3 — 8 мин.

Ополаскивают в проточной воде 3 — 5 мин.

Проводят через 0,5 % раствор соляной кислоты 1 мин.

Промывают 2 — 3 мин в дистиллированной воде и 3 — 5 мин — в проточной, контролируя процесс под микроскопом.

Переносят в 0,1 % раствор карбоната лития на 1 мин.

Ополаскивают в дистиллированной воде и 96 % спирте.

Переносят в 100 % спирт на 1 мин.

Окрашивают в растворе оранжевого G 1 — 3 мин.

Проводят через 96 % спирт в течение 2 мин, контролируя процесс под микроскопом.

Окрашивают в светлом зеленом (смесь ЕА-36) 2 мин.

Проводят через 96 % спирт 1 — 3 мин.

Промокают фильтровальной бумагой, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Применяют следующий вариант окрашивания гематоксилином и эозином для мазков.

Для приготовления красителя 50 г алюмокалиевых квасцов растворяют в 500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения и высыпают в горячий раствор 1 г гематоксилина. Затем добавляют 500 мл дистиллированной воды и доводят до кипения (но не кипятят). Раствор остужают до комнатной температуры и добавляют йодат калия. Горло сосуда завязывают марлей и оставляют созревать на свету 5 недель. Затем сосуд с красителем закупоривают и убирают в темное место. Перед использованием краситель фильтруют.

Мазки фиксируют в смеси равных частей эфира и 96 % спирта или в 96 % спирте 7—10 мин.

Окрашивают в гематоксилине 5 мин.

Промывают в проточной воде 1 — 2 мин.

Окрашивают в 0,3% спиртовом растворе желтоватого эозина 1 мин.

Источник

Вам также может понравиться

Ясень семена способ распространения

Ясень обыкновенный Fraxinus excelsior – так в ботанической

Ярлыки способы создания ярлыков ос windows

Создаем ярлыки на рабочем столе Windows Создаем ярлыки

Японское удобрение фуджима способ применения

Удобрения Фуджима Знаете потрясающее удобрение, палочка

Японский чай способ заварки

Технология заваривания японского чая Известно, что