Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов.
В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов. Они относятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулеза крупного рогатого скота, проказы человека). Химическая структура цитоплазмы и клеточной оболочки микроорганизмов данной группы отличается содержанием значительного количества жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому проникновение красителя в клетку затруднено. Для их окраски используют протравливание (нагревание мазка с красителем над пламенем). Окрасившись, они прочно удерживают краску и не обесцвечиваются кратковременным действием кислоты.
Окраска по Циль-Нильсену.
1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой.
2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в течение 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.
Мазок тщательно промывают водой.
5. Снова промывают водой.
6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зелени или метиловой зелени.
7. Краску смывают водой и препарат высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото — и спиртоустойчивых сапрофитов, — синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото — и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото — и спиртоустойчивы.
Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов.
Цель занятия.Усвоить методы окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий, а также определение подвижности бактерий.
Материалы и оборудование. Взвеси бактерий с вакцинным штаммом сибирской язвы, клостридиями, готовые препараты с капсулообразующими бактериями, подвижные бульонные культуры эшерихий 18 часового роста, предметные и покровные стекла, плакаты, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый фуксин Циля.
Методические указания. Каждый студент готовит мазки из взвесей микроорганизмов и окрашивает их по методу Трухильо, Ольта, микроскопирует и зарисовывает; готовит препарат для изучения подвижности микроорганизмов методом «раздавленная» и «висячая» капля.
Окраска спор. При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к родуBacillusи называются бациллами. Микроорганизмы родаClostridiumимеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями. По форме они бывают овальные и круглые (рис. 5).
Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей.
Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.
Техника окраски спор методом Трухильо. На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят водный раствор малахитовой зелени.
Рис. 5. Споры микроорганизмов различных типов
Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные клетки красные.
Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула — муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;
б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула — в другой;
в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в краснокирпичный цвет, капсула в — желто-оранжевый. Определение подвижности бактерий.
Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков— специальных тонких нитевидных образований.
Рис.6.Капсула у бактерий а ‑ бацилла сибирской язвы; б — диплококк
Жгутики бывают различной длины.
Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют (рис. 7):
а) монотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);
Рис. 7. Типы расположения жгутиков у бактерий
б) лофотрихи— микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);
в) амфитрихи— микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;
г) перитрихи — микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E.coli).
Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.
Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.
Определение подвижности бактерий методом «висячая капля». Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой (рис. 8). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые. Методом Шукевича. Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
Рис. 8. Исследование микробов на подвижность а ‑ стекло с луночкой; б ‑ «висячая капля»
Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Метод посева уколом в полужидкий агар. Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная — только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
ЗАНЯТИЕ 5. Лабораторная посуда и её подготовка. Питательные среды. Методы приготовления и стерилизации питательных сред. Методы стерилизации лабораторной посуды.
Цель занятия. Подготовить посуду. Приготовить питательные среды. Определить рН сред. Ознакомиться с методами стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.
Оборудование и материалы.Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки, чашки Петри, бумага. Автоклав, сушильный шкаф. Набор сред и химических реактивов. рН -метр.
Источник
Окраска кислотоустойчивых микробов
Кислотоустойчивость микробов зависит не только от наличия в них значительного количества липидов (около 36%), но и от ряда других химических и физических факторов. Так, например, установлено, что при нарушении целостности фиксированных клеток возбудителя туберкулеза путем растирания их между стеклами эти микробы теряют кислотоустойчивость.
Окраска по методу Циль-Нильсена
1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и промывают мазок водой.
2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в течение 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.
3. Мазок тщательно промывают водой.
4. Споласкивают 96°спиртом.
5. Снова промывают водой.
6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором (1:1000) малахитовой зелени или метиловой зелени.
7. Краску смывают водой, препарат высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — рубиново-красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото- и спиртоустойчивых сапрофитов — синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл + 96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото- и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото- и спиртоустойчивы.
Окраска в модификации Синева.
Фильтровальную бумагу пропитывают 2% спиртовым раствором основного фуксина, сушат и нарезают на полоски. На фиксированный мазок наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают полоску окрашенной бумаги, нагревают до появления паров и далее обрабатывают по оригинальной прописи Циль-Нильсена.
Мирохин (1941) рекомендует при отсутствии основного фуксина окрашивать мазки на туберкулез по видоизмененному способу Чистовича:
1. окраска генцианвиолетом или метилвиолетом на анилиновой воде с подогреванием — 2 минуты,
2. промывание водой,
3. обесцвечивание 2-5% азотной кислотой 8—10 секунд,
4. промывание водой,
5. обесцвечивание спиртом до побледнения,
6. промывание водой,
7. докрашивание 0,1% сафранином несколько секунд,
8. промывание водой и высушивание.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — фиолетовые на красном фоне. Кислотоустойчивость того или иного микроорганизма можно определить флуоресцентным методом. У этого метода есть преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается присутствие, например, микобактерий, можно просматривать под объективом с увеличением 60 ´ , а не 100 ´ ; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время.
Метод Труанта для окрашивания на кислотоустойчивость.
| Реактив для флуоресцентной окраски: | |
| Аурамин О, С141000 | 1,5 г |
| Родамин В, С1 749 | 0,75 г |
| Глицерин | 75 мл |
| Фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) | 10 мл |
| Дистиллированная вода | 50 мл |
Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фенолом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова перемешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4°С или при комнатной температуре.
| Растворитель для обесцвечивания: | |
| Этанол 70% (объем/объем) | 99,5 мл |
| Соляная кислота (концентрированная) | 0,5 мл |
| Дополнительный краситель: | |
| Марганцевокислый калий | 0,5 г |
| Дистиллированная вода | 99,5 мл |
Выполнение методики:
1. Погружают фиксированный нагреванием бактериальный мазок на 15 минут в реактив для флуоресцентной окраски при 20—37°С.
2. Промывают мазок под слабой, падающей под углом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.
3. На 2—3 минуты погружают мазок в обесцвечивающий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.
4. Погружают мазок в дополнительный краситель на 2—4 минуты.
5. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают фильтровальной бумагой.
Просматривают образцы в люминесцентный микроскоп с использованием возбуждающего светофильтра типа BG-12 и запирающего светофильтра типа OG-1. Клетки кислотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оранжевым светом на темном фоне.
Для микроскопической дифференциальной диагностики туберкулезных палочек от спиртоподатливых сапрофитов существует несколько методов.
Метод Гонзеля
1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании до кипения в течение 2 минут.
2. Промывают водой и высушивают.
3. Обесцвечивают смесью соляной кислоты (3 части) и абсолютного или 95° алкоголя (97 частей) в течение 10 минут.
4. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки, разбавленным водой в 2 раза.
5. Промывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.
Метод Бунге и Траутенрота
1. Помещают препарат на 3 часа в абсолютный алкоголь (для извлечения жира).
2. Наносят на мазок 5% водный раствор хромовой кислоты на 15 минут.
3. Промывают водой.
4. Окрашивают при подогревании карболовым раствором фуксина.
5. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 минут.
6. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки не менее 5 минут.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.
Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость)
Препарат окрашивают карболовым фуксином при подогревании до появления паров, промывают водой, а затем окрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2—3 минут. Мазок обмывают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — красные на синем фоне, а кислотоустойчивые, но спиртоподатливые палочки — синие.
Если требуется проверить в уже окрашенном по Циль-Нильсену мазке обнаруженные кислотоустойчивые палочки на спиртоустойчивость, нужно: удалить с препарата кедровое масло бензином или ксилолом, докрасить мазок насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2-5 минут, обмыть водой и высушить. Кислото- и спиртоустойчивые палочки сохраняют свой красный цвет, а спиртоподатливые окрасятся в синий цвет.
Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)
1. На фиксированный мазок наливают профильтрованную смесь из 10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета и 100 мл 2% карболовой воды (смесь пригодна 3 дня) и нагревают до кипения 4—5 раз, постоянно добавляя свежий раствор краски, или же оставляют на 24-48 часов при комнатной температуре;
2. Не промывая водой, на мазок наливают раствор Люголя на 10—15 минут;
3. Промывают водой;
4. Обесцвечивают сначала 5% раствором азотной кислоты в течение минуты, затем:
5. Обесцвечивают 3% раствором соляной кислоты в точение 10 секунд
6. Обесцвечивают смесью спирта и ацетона (1:1) до полного обесцвечивания мазка (до прекращения растворения краски);
7. Дополнительно окрашивают разведенным (1:10) фуксином или 1% водным раствором сафранина в течение нескольких секунд;
8. Ополаскивают водой, высушивают.
Микроскопическая картина: на красном (коричневом) фоне — сине-фиолетовые палочки и резко ограниченные зерна.
Модификация окраски Грам—Муха
Мазок сначала окрашивают смесью из 3 частей карболового раствора фуксина с 1 частью метилвиолета по Муху (см. выше), затем продолжают окраску по оригинальной прописи.
Микроскопическая картина: палочки — красного цвета, зерна — темно-фиолетовые.
Способ Нейссера
(Используется для окраски метахроматических зерен — волютина).
| Раствор А | |
| Метиленовая синька | 0,1 г |
| Этиловый спирт 95° | 2 мл |
| Ледяная уксусная кислота | 5 мл |
| Дистиллированная вода | 100 мл |
| Раствор Б | |
| Кристаллвиолет | 1 г |
| Этиловый спирт 95° | 10 мл |
| Дистиллированная вода | 300 мл |
Для окраски смешивают 2 части раствора А с 1 частью раствора Б.
Техника окраски. На фиксированный мазок наливают смесь растворов А и Б, через минуту краску сливают, мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем промывают водой и докрашивают в течение 2—3 минут раствором хризоидина (1 г краски в 300 мл дистиллированной горячей воды), промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина: зернистость — темно-синяя, тела бактерий —светло-желтые.
Источник
