Способы окрашивания хромосом человека
Обнаруживаемые в геноме человека 24 типа хромосом легко распознаются на цитологическом уровне множеством специфических методов окрашивания. Часто используют три метода окрашивания, разделяющие хромосомы человека. Ранее в статьях на нашем сайте МедУнивер мы познакомились с окраской хромосом методом Гимзы (G-окраска), наиболее часто используемой в клинических лабораториях. Для специфических целей в некоторых лабораториях используют другие окраски.
Окраска Q. В этом методе используют препараты акрихина (или подобных) и применяют флюоресцентную микроскопию. Хромосомы окрашиваются в виде специфических наборов светлых и темных полос (Q-полосы), светлые полосы почти точно соответствуют темным полосам при G-окраске. Q-, а также С-окраска особенно полезны для выявления редких вариантов строения хромосом или окраски, называемых гетероморфизмом.
Такие варианты обычно безобидны с клинической точки зрения и отражают различия в объеме или типе сателлитных последовательностей ДНК в конкретном положении на хромосоме.
Окраска R. Если хромосомы перед окрашиванием специально обработать (например, нагреть), полученные темные и светлые полосы будут противоположны таковым при G- или Q-окрасках и, соответственно, называются R-полосами. R-окраска позволяет легче анализировать области, плохо красящиеся при G- или Q-окрасках. Это стандартный метод в некоторых лабораториях, особенно в Европе.
Для идентификации хромосом человека, окрашенных любым из трех упомянутых методов, принята единая международная система классификации хромосом. На рисунке приведена схема (идеограмма) окраски нормальных хромосом человека в метафазе, иллюстрирующая набор темных и светлых полос, используемый для идентификации хромосом. Последовательность полос в каждой хромосоме перечисляется на обоих плечах от центромеры к теломере.
При использовании этой системы нумерации может быть точно и однозначно указана позиция любой конкретной полосы, также как последовательности ДНК или гена, и участие ее в хромосомной аномалии.
По положению центромеры хромосомы человека часто классифицируют на три типа, которые легко различаются в метафазе : метацентрические хромосомы, с более или менее центральным расположением центромеры и плечами приблизительно равной длины; субметацентрические хромосомы, с центромерой, смещенной от центра, и плечами, четко отличающимися по длине; и акроцентрические хромосомы, с центромерой, расположенной около одного конца.
Потенциальный четвертый тип хромосом, телоцентрический, с центромерой на одном конце и единственным плечом, не представлен в нормальном кариотипе человека, но иногда бывает при хромосомных перестройках и часто встречается у некоторых других видов. Акроцентрические хромосомы человека (хромосомы 13, 14, 15, 21 и 22) имеют небольшие, отчетливые массы хроматина, известные как спутники, присоединенные к их коротким плечам тонкими нитями (вторичными перетяжками).
Спутничные нити этих пяти хромосом содержат сотни генов, кодирующих рРНК (основной компонент рибосом), а также различные повторяющиеся последовательности.
В конкретных ситуациях может быть использовано множество специализированных методов.
Окраска С специфично окрашивает околоцентромерную область каждой хромосомы и другие участки, содержащие конститутивный гетерохроматин, а именно смежные с центромерой области хромосом lq, 9q и 16q и дистальную часть длинного плеча Y-хромосомы (Yq). Гетерохроматин — тип хроматина, который всегда остается в конденсированном состоянии и окрашивается в интерфазных клетках.
Окраска высокого разрешения (также называемая прометафазной окраской) получается окрашиванием G- или R-методом хромосом, полученных на ранней стадии митоза (в профазе или прометафазе), когда они находятся в сравнительно неконденсированном состоянии. Окраска высокого разрешения особенно полезна при подозрении на аномалии тонкой структуры хромосомы; некоторые лаборатории стандартно используют прометафазную окраску.
Прометафаза деления позволяет выявить от 550 до 850 и даже более полос в гаплоидном наборе хромосом, тогда как на стандартном препарате метафазы видно только около 450 полос. Очевидно увеличение диагностической точности, получаемой при анализе более длинных хромосом.
Ломкие участки — неокрашиваемые промежутки, иногда наблюдаемые в характерных местах в различных хромосомах. Чтобы обнаружить ломкие участки, обычно необходимо подвергать клетки воздействию особых условий выращивания или химических веществ, изменяющих или тормозящих синтез ДНК. Известно множество наследуемых вариантов ломких участков.
Наиболее очевидно клиническое значение ломких участков на длинном плече Х-хромосомы у мальчиков с часто встречающейся специфической формой сцепленной с полом умственной отсталости, а также у некоторых женщин — носителей этого генетического дефекта.
Обнаружение ломкого участка в Х-хромосоме — диагностическая процедура, специфичная для синдрома ломкой Х-хромосомы, хотя в большинстве лабораторий этот тест заменен или дополнен молекулярным тестированием для обнаружения экспансии тринуклеотидного повтора CGG в гене этого заболевания FMR1.
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Источник
Научная электронная библиотека
Соколова Т А, Котловский Ю В, Дубынина Е В, Ивановская О В, Веселова В К, Кузнецова Е Ю,
1.2. Окрашивание хромосом
В зависимости от целей цитогенетического исследования используются различные методы окрашивания хромосом. Наиболее распространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G-, C-, R- и NOR- или Ag-окраска. В свою очередь методы дифференциального окрашивания делятся на две группы:
1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например Q-, G- или R-сегменты);
2) приводящие к окрашиванию специфических хромосомных структур, в результате чего выявляется ограниченное число сегментов (С-, Т- или NOR-сегменты).
Для обозначения вида окраски используется система трехбуквенного обозначения, включающая основной метод окраски, вариант предварительной обработки препарата хромосом и название красителя (GTG, RHG, QFQ и т.д.). Структуры, выявляющиеся по длине хромосом в соответствии с типом окраски называют Q-, G-, C-, R-сегментами (bands).
Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окрашивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азур-эозином), без какой либо предварительной обработки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хромосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные морфологически сходные хромосомы. Рутинная окраска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959–1970 гг., до внедрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В настоящее время она практически не применяется для диагностики конституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факторов среды на мутагенную активность.
Q-окраска (от англ. Quinacrine – акрихин) выявляется на хромосомах в виде чередования ярко- и темнофлюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителями) как производные акридина – акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присоединяться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ионных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ) по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека принадлежит шведскому цитогенетику Касперсону (1970). В популяциях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдельных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски – Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светящихся сегментах, локализованных в центромерных участках хромосом 3 и 4, а также в коротких плечах и спутниках всех акроцентрических хромосом человека 13–15, 21 и 22. кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y – сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все перечисленные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются областями локализации гетерохроматина – некодирующихся повторяющихся последовательностей ДНК, вариабельность которых не приводит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть использованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских проблем.
G-окраска (от англ. Giemsa – Гимза) выявляется благодаря предварительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске красителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хромосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гетерохроматиновым районам, а светлые – эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой лаборатории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом человека была впервые предложена английской исследовательницей Мариной Сибрайт (Seabright) в 1972 году и практически в неизменном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски аналогичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что:
а) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сегменты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гимза;
б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3, 4, 13 – 15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется около 320 сегментов на гаплоидный геном.
R-окраска (от англ. Reverse – обратная) отличается противоположностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми – гетерохроматиновые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каждый из них имеет кодировку по международной цитогенетической номенклатуре. Наиболее приемлемой является обработка препаратов Ba(OH)2 с прогреванием их при 60 °С и последующей отмывкой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом – RHG.
С-окраска (от англ. Constitutive heterohromatin – конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые участки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С-окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухчасовой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе (2?SSC) при 65 °С. В качестве щелочных растворов обычно применяют гидрат окиси бария или натрия. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (GBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повторяющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хроматина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашивания, существует межиндивидуальная вариабельность по определенным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют 4 типа С-хроматина:
1) собственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относительно небольшими по площади темноокрашенными блоками;
2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромерных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом;
3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола;
4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом.
Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет прежде всего оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора – 1, 9, 16 и Y, а также используется в практике клинической цитогенетики для уточнения характера структурных перестроек, затрагивающих данные хромосомы. По международной цитогенетической номенклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h – гетерохроматин). Например, запись кариотипа 46,ХХ,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым блоком в длинном плече, а запись 46,XYqh– означает, что у мужчины имеется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном плече хромосомы.
NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region – Ядрышко-Образующие Районы – ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) – применяется для выявления ядрышкообразующих районов, расположенных в коротких плечах (сегмент q12 – спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13, 14, 15, 21 и 22), с помощью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышковых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Ряды рРНК транскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последовательностями – спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскрибируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий рибосомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка, основанный на использовании комбинации 50 % раствора нитрата серебра с желатиновым проявителем окраски в условиях прогревания препаратов при 60 %С. С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет, а в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных нитях четко выделяются черные точечные образования – глыбки восстановленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отражающие активность ЯОР, на разных хромосомах существенно варьируют – от отсутствия заметной окраски, до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски ядрышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромосомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балльная система оценки активности ЯОР каждой из 5 пар акроцентрических хромосом генома человека (0 – отсутствие окраски, 1 – слабая, 2 – средняя, 3 – сильная, 4 – очень сильная окраска ЯОР хромосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают толщину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР. В популяциях человека существует межиндивидуальный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных индивидов, являющейся наследуемой характеристикой.
Т-окраска (от англ. Telomere – теломера) – применяется для выявления теломерных районов хромосом в коротких и длинных плечах.
Источник
