Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью световых или электронных микроскопов. Гистологические препараты представляют собой мазки, отпечатки органов, пленочные препараты, тонкие срезы кусочков органов, окрашенные тем или иным красителем (исследуются также нативные — неокрашенные срезы), помещенные на предметное стекло, заключенные в бальзам и покрытые тонким покровным стеклом.
Для изготовления гистологического препарата необходимо после взятия материала произвести его фиксацию в том или ином фиксаторе (формалине, спирте, а для электронной микроскопии — в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия). Делается это для предотвращения процессов аутолиза и сохранения структуры органа, близкой к прижизненной. Далее следуют этапы обезвоживания кусочка органа в спиртах возрастающей концентрации и в ксилоле с целью уплотнения тканей, что необходимо для изготовления тонких срезов. Для придания кусочку органа еще большей плотности и гомогенности, обеспечивающей высококачественную резку, проводят его заливку в органическую среду — парафин, целлоидин (для световой микроскопии) и органические смолы (эпон, аралдит, дуркупан) — для электронно-микроскопического исследования.
Существуют также физические способы фиксации материала, наиболее распространенным из которых является быстрое замораживание кусочка органа с помощью жидко.го азота и других средств. Для резки замороженного материала используют специальные приборы — криостаты, или замораживающие микротомы.
Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм, для электронной — 50-60 нм (такие ультратонкие срезы изготавливают на специальном приборе ультратоме, используя стеклянные или алмазные ножи и автоматический режим резки).
После получения срезов их помещают на предметные стекла, далее следуют этапы освобождения срезов от заливочной среды (при световой микроскопии) и окраски для придания срезам контрастности. Среди гистологических красителей наиболее часто употребляется сочетание гематоксилина, маркирующего ядро (кислотные молекулы), и эозина, избирательно окрашивающего белковые молекулы (цитоплазматический краситель).
По окончании окрашивания срезы заключают в консервирующие среды (канадский, кедровый бальзамы) и накрываются покровным стеклом.
Основным методом гистологического исследования клеток, тканей и органов является световая микроскопия. В световом микроскопе для освещения объекта используются лучи видимого спектра. Современные световые микроскопы позволяют получать разрешение порядка 0,2 мкм (разрешающая способность микроскопа — это то наименьшее расстояние, при котором две рядом расположенные точки видны как отдельные). Разновидности световой микроскопии — фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная, темнопольная и др.
Фазово-контрастная микроскопия — метод изучения клеток в световом микроскопе, снабженном фазово-контрастным устройством. Благодаря смещению фаз световых волн в микроскопе такой конструкции повышается контрастность структур исследуемого объекта, что позволяет изучать живые клетки.
Интерференционная микроскопия. В интерференционном микроскопе падающие на объект световые пучки раздваиваются — один пучок проходит через объект, другой — идет мимо. При последующем воссоединении пучков возникает интерференционное изображение объекта. По сдвигу фаз одного пучка относительно другого можно судить о концентрациях различных веществ в исследуемом объекте.
Поляризационная микроскопия. В микроскопах этого типа световой пучок разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Проходя через структуры ткани со строгой ориентацией молекул, лучи запаздывают друг относительно друга вследствие неодинакового их преломления. Возникающий при этом сдвиг фаз является показателем двойного лучепреломления клеточных структур (таким способом были исследованы, например, миофибриллы).
Источник
Способы окрашивания гистологических препаратов
В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
В микроскоп входят 3 системы —
оптическая, осветительная и механическая.
1.Оптическая система включает объектив и окуляр.
а ) Объектив (1) — это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда — и название).
Обычные увеличения объектива:
8 , 20 , 40 (сухие объективы),
90 (иммерсионный объектив).
Схема — строение светового микроскопа.
Полный размер
При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15.
в) Результирующее увеличение микроскопа — произведение увеличений объектива и окуляра, например:
20 10 = 200 раз.
г) Таким образом, функция оптической системы —
формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
2. Осветительная система — источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример — обычная настольная лампа).
б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.
Одна поверхность зеркала — плоская, вторая — вогнутая; последняя используется при искусственном освещении.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.
Она ограничивает световой поток, падающий на препарат. При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить — для ослабления сферической аберрации.
3. Механическая система — тубус (2) , штатив (8) , колонка (9) и предметный столик (10) .
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты .
Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.
Макровинт используется при работе на малом увеличении, а микровинт — на большом.
б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3) .
Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете , для чего препарат должен быть достаточно тонким. Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:
а) срезы органов (толщиной 5-15 нм), б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки), в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты
Чаще всего используются срезы.
2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:
а) взятие и фиксация материала, б) обезвоживание и уплотнение материала, в) приготовление срезов, г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.
1.1.2.1. Взятие и фиксация материала
1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) — обычно на 24 ч.
2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков .
3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
1. Затем образцы уплотняют — чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин.
2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).
а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов —
70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол — по 24 часа в каждом спирте.
б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.
3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин
Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике.
1.1.2.3. Приготовление срезов
1. Кубики вставляют в специальный прибор — микротом , — служащий для приготовления срезов.
2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).
б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.
3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем — на предметное стекло.
1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду
1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина , проводя по батарее растворителей:
ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)
(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)
2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами
помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой.
3. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) — для удаления лишней краски.
4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.
1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления
1. Примеры тотального препарата — участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле.
2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два —
уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).
фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду.
В остальных же случаях (т.е. при получении срезов) приготовление гистологического препарата — весьма долгая и трудоёмкая процедура. Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.
1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов
1.1.3.1. Типы красителей
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-
Тип красителя
Пример
Окрашиваемые структуры
Кислые красители
Кислоты и кислые соли :
эозин (искусственная краска; название — от греч. эос — заря);
кислый фуксин .
а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям).
б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители
Основные с оли :
гематоксилин (точнее, продукт его окисления — гематеин);
азур 2, кармин.
а) К расящиеся структуры — базофильные (сродство к основным красителям).
б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами — ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители
Смесь двух красителей:
основного ( азур 2 ) и кислого ( эозин ).
а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример — специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах.
б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индифферент- ные красители
Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).
Существует большое количество различных способов окраски. Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.
1.1.3.2. Общие методы окраски
1. Окраска гематоксилин -эозином
1. а) Самый распространённый метод окраски.
б) Сочетает основной и кислый красители.
в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.
2. Ядра пр иобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма — желтовато-розовый цвет.
3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
2. Окраска железным гематоксилином (по методу Генденгайна)
1. Препарат
предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином.
а) Краситель — смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.
б ) Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвет , а элементы других тканей (напр., мышечные волокна) — в жёлтый цвет.
2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;
б) многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) — в оранжевый или красный цвет.
3.Импрегнация серебром
1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем — восстановителями.
б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –
2.Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрный цвет, коллагеновые волокна — коричневый , ядра клеток — светло-коричневый .
4. Окраска орсеином
Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет ;
остальные структуры — в слабо-розовый цвет .
5. Окраска гематоксилин- пикрофуксином
Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет ,
коллагеновые волокна — в красный цвет ,
ядра клеток — окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет.
6. Окраска по методу Шморля
1. Используется для окраски костей и дентина.
2. а) Предварительно кусочки материала подвергают декальцинации (с помощью кислоты), а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов.
б) Краситель — раствор тионина.
3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;
б) остальной фон — светло-коричневый .
1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови
1. Окраска азур 2 – эозином
Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий,
а оксифильные — в светло-красный цвет.
2. Окраска мазков по методу Романовского
1. а) Краситель — тот же, что и в предыдущем случае (азур 2 – эозин).
б) Отличия же от приготовления срезов таковы:
фиксацию мазков проводят чистым метанолом ; окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч; для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам.
2. Эритроциты приобретают бледко-красный цвет,
цитоплазма лейкоцитов — голубой или синий цвет,
цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.
1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы
1.Импрегна- ция нитратом серебра
1. Особенности предварительной обработки препарата.-
Фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней .
Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу), а путём замораживания .
Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.
2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами
3. а) Элементы нервной системы (волокна, клетки и т.д.) окрашиваются в чёрный цвет, б) окружающие ткани — в светло-коричневый цвет.
2. Окраска толуидино- вым синим по методу Ниссля
1. Толуидиновый синий окрашивает умеренно базофильные соединения в синий цвет.
2. С его помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).
3. Окраска метиловым зелёным- пиронином по методу Браше
1. Метод служит для выявления РНК .
2. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования. б) Поэтому подробней описывается ниже.
1.1.4. Гистохимические методы исследования
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
1а) РНК
Реакция Браше.
1. Реактив (как отмечалось, — смесь двух красителей: метилового зелёного и пиронина.
2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет . Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.
б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) — зелёные .
3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.
1б) ДНК
Реакция Фёльгена.
1. Основной реактив — фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).
2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет .
2. Белки
Используются различные реакции; в том числе:
а) с бромфеноловым синим (у белков — тёмно-фиолетовая окраска ); б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет ).
3а) Полисахариды
ШИК-реакция.
1. Реактив — Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ).
2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.
3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет .
3б) Гликозамин- гликаны
Реакция с толуидиновым синим.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия
— изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.
2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани — гликозамингликаны
(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
4. Нейтральный жир
Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось).
Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.
1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).
2. а) Ядра клеток (2) — базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.
б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.
1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III — гематоксилином
2. Препарат — белая жировая ткань. Тотальный препарат сальника. Окраска судан III -гематоксилином.
1. а) Препарат является тотальным.
б) Это означает, что перед нами — не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.
2. а) Жировые клетки на препарате заполнены крупными каплями жира (1) , которые окрашены суданом Ш в ярко-оранжевый цвет.
Полный размер
б) Клеточные ядра (2) , окрашенные гематоксилином в фиолетовый цвет, оттеснены к периферии клетки.
1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю
3. Препарат— пластинчатая костная ткань.Поперечный срез трубчатой кости. Окраска по методу Шморля.
1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).
2. Применённый метод окраски позволяет выявить стенки костных полостей (1) и канальцев (2) , окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.
3. В костных полостях находятся тела костных клеток (остеоцитов), а в канальцах — отростки этих клеток.
1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори
4. Препарат — срез яичника кролика.Окраска по методу Маллори.
1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.
2. На снимке — женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.
3. Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый ,
окружающая её блестящая оболочка (2 ) — в голубой ,
а ядра фолликулярных клеток (3) — в фиолетовый цвет.
1.2. Электронная микроскопия
Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз, то в электронном микроскопе — 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше .
1 . В электронном микроскопе образец облучается не видимым светом, а пучком электронов .
Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой. Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше.
2. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки.
Внешний вид электронного микроскопа
1.2.1.2. Ход лучей
Ход лучей в электронном микроскопе, в принципе, таков же, как в световом.-
1. а) Источником электронов служит катод (1) ,
а движущей силой — разность потенциалов между катодом и анодом (2).
б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.
в) Чтобы их поток далее не ослабевал, в тубусе микроскопа создаётся высокий вакуум .
Схема — ход лучей в световом (I) и электронном (II) микроскопе.
I
II
Полный размер
2 . а) Одна электромагнитная катушка (3) служит в качестве конденсора (фокусирует пучки на образце (4) ),
б) вторая катушка (5) — в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),
в) а третья катушка (6) — в качестве окуляра, или проекционной линзы.
3 . Лучи, проходящие через последнюю катушку, попадают далее на люминесцентный экран (7) и вызывают его свечение в месте падения электронов.
1.2.2. Особенности приготовления препарата
1. Взятие материала и фиксация
Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3 ), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:
вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
затем — четырёхокисью осмия ( стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
2. Уплотнение материала
1. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы .
2. а) Заливку производят в специальных формах,
б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,
в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей .
3. Приготовление срезов
1. Срез делают с помощью ультратома ; их толщина — 30-50 нм (ср. с микротом ными срезами — 10.000 – 20.000 нм).
2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла).
4. Окрашивание срезов
1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана).
б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.
8 , 
зеркало (5) 
Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий, 
азотнокислого серебра,
