4. Изолирование и очистка
Изолирование пестицидов, в большинстве случаев, осуществляют экстракцией различными органическими растворителями: пентан, гептан, петролейный эфир, хлороформ, четыреххлористый углерод и др. В некоторых случаях используют полярные растворители, например, для изолирования производных арилоксикарбоновых кислот. Также возможна перегонка с водяным паром (ртутьорганические соединения, никотин, анабазин).
Единого универсального метода изолирования пестицидов, так же как и общей схемы очистки полученных экстрактов, не существует.
Рекомендуются методы изолирования пестицидов для каждого конкретного объекта исследования (воздух, пищевые продукты растительного происхождения, почва, кровь, моча и т.п.) и конкретного препарата.
Методы очистки пестицидов, выделенных из биологических объектов, также разнообразны. Имеет место очистка перегонкой с водяным паром, экстракцией, кристаллизацией, хроматография в тонких слоях сорбента.
5.Анализ пестицидов
Качественный анализ и количественное определение пестицидов проводятся по нативному веществу, либо по метаболитам, которые обнаруживают, используя хроматографические и биохимические методы анализа. При рассмотрении отдельных групп и представителей пестицидных препаратов будут приведены подходы к проведению химико-токсикологического анализа.
6.Основные группы пестицидов
Хлорорганические пестициды (ХОП) применяют в сельском хозяйстве в качестве активных инсектицидов, акарицидов и фумигантов в борьбе с вредителями зерновых и технических культур. По химической природе пестициды этого класса представляют собой хлорпроизводные ароматических углеводородов, циклопарафинов, терпенов. К ним относятся гексахлорбензол, гексахлорбутадиен, -изомер ГХЦГ, ДДТ, ДДД, дилор, кельтан, метоксихлор и др. Они могут длительно (до 1,5 — 10 лет и более) сохраняться в почве, воздействовать на почвенную фауну и переходить в произрастающие растения. Из-за высокой устойчивости в окружающей среде и способности к биоконцентрации ХОП превратились в глобальные загрязнители. Им присущи сверх- и выраженная кумуляция. Большинство ХОП плохо растворимы в воде, но хорошо — в органических растворителях, в том числе — жирах.
Изолирование ХОП основано на экстракции пестицида из измельченного объекта органическим растворителем (н-гексан), для ГХЦГ возможна перегонка с водяным паром. Качественный и количественный анализ сводится, в большинстве случаев, к отщеплению одного или нескольких атомов хлора и последующему обнаружению хлоридов и ароматического ядра методами ТСХ и ГЖХ с электронно-захватным детектором (ДЭЗ).
Метаболизм хлорированных ароматических углеводородов — гексахлор-бензола, ДДТ и его аналогов во внешней среде и различных биологических средах протекает по восстановительному и дегидрохлорированному механизмам. Общепризнан ряд возможных путей метаболизма ДДТ в живых тканях: окисление до ДДА (дихлордифенилуксусная кислота); дегидрохлорирование до ДДЭ (2,4-дихлорэтилен); восстановительное дехлорирование до ДДД (4,4-дихлордифенилдихлорметилметан).
ДДД — активный контактный инсектицид, лишь несколько уступающий ДДТ по токсичности. Для теплокровных особенно опасна его высокая хроническая токсичность.
Реакция дегидрохлорирования свойственна также и другой группе ХОП, например, продуктам хлорирования циклопарафинов, к которым относится гексахлорциклогексан (ГХЦГ). Под влиянием микроорганизмов ГХЦГ превращается в пентахлорциклогексан, переходящий затем в трихлорбензол, который, в свою очередь, взаимодействует с сульфгидрильными группами аминокислот.
ХОП обладают эмбриотоксическим действием, вызывают пороки развития и мутагенные изменения. Некоторые являются канцерогенами и аллергенами, что явилось основанием для ограничения, либо запрещения их применения в отдельных регионах России.
Пестициды из класса фенолов
Фенолы проявляют широкий диапазон физиологического действия и являются фунгицидами, бактерицидами, инсектицидами и гербицидами. Причем пестицидная активность фенолов возрастает при введении в ароматический радикал различных заместителей, особенно нитрогруппы. Из многочисленных производных динитропроизводных фенолов практическое значение приобрели ДИНОК и ДИНОСЕБ.
По физическим свойствам оба препарата представляют собой желтые кристаллические вещества. Изолирование при ХТА из внутренних органов трупа, крови, мочи возможно как подщелоченной, так и подкисленной водой, очистка – хроматографией в тонком слое силикагеля. Качественное обнаружение проводят по реакции с раствором натрия гидроксида – появляется желтое окрашивание, либо с использованием других реакций, характерных для фенолов. Количественное определение проводят СФМ методом, максимум поглощения наблюдается при 370 нм.
Производные карбаминовых кислот — карбаминаты (эфиры карбаминовой кислоты). Наиболее широкое применение нашел севин. Изолирование при ХТА из внутренних органов трупа производится повторной экстракцией бензолом. Качественное обнаружение основывается на предварительном гидролизе севина до α-нафтола и последующем его доказательстве следующими реакциями:
1. С купробромидом натрия после нагревания появляется фиолетовое окрашивание.
2. С 4-аминоантипирином – оранжево-красное окрашивание.
3. С 0,5% раствором NaNO2 в кислоте серной разбавленной появляется желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при создании щелочной среды.
Количественное определение севина проводят ФЭК методом после его щелочного гидролиза до α-нафтола и последующем вовлечении последнего в реакцию с купробромидом натрия.
Фосфорорганические пестициды (ФОП). Одна из наиболее распространенных и многочисленных групп пестицидов. К ним относятся афуган, актеллик, дибром, карбофос, бромофос, фталофос, хлорофос, цидиал и др. Большинство ФОП обладают высокой летучестью, слаборастворимы в воде, хорошо – в органических растворителях. По стойкости в окружающей среде значительно уступают ХОП. Однако некоторые из них сохраняют свои токсические свойства в почве и на растениях в течение нескольких месяцев и более, в результате чего возможно их поступление в организм человека с продуктами питания, воздухом и водой. Способны проникать через неповрежденную кожу, различные биологические мембраны и гематоэнцефалический барьер. Установлено, что в течение 11 недель 30% немакура, внесенного в почву, поглощается растениями. Более устойчивы остаточные количества ФОП в плодах цитрусовых. Это объясняется их растворением в маслах кожуры плодов.
Хотя ФОП не накапливаются в организме ток интенсивно, как ХОП, они все же обладают кумулятивными свойствами в результате суммирования токсических эффектов — функциональной кумуляцией.
В клинической практике наиболее часто встречаются острые отравления карбофосом, хлорофосом, метафосом. Летальная доза для человека при приеме per os составляет для метафоса 0,2-2 г, для карбофоса, хлорофоса – 5-10 г.
Токсическое действие ФОП связано с угнетением активности холинэстеразы (ХЭ). При взаимодействии ХЭ с ФОП образуется устойчивый к гидролизу, либо не способный к нему (в случае воздействия, например, зорина) фосфорилированный фермент, не способный регулировать процессы разложения ацетилхолина в синапсах. В результате накопления ацетилхолина наблюдаются характерные изменения в ЦНС и вегетативной нервной системе, проявляющиеся головной болью, ухудшением памяти, нарушением сна, дезориентацией в пространстве, бронхоспазмами, судорогами, угнетением дыхания. Для некоторых характерны невриты, парезы, параличи.
В организме метаболизм ФОП протекает по пути окисления (с потерей радикалов), десульфирования и дехлорирования. При этом могут образовываться более токсичные соединения.
К осложнениям, развивающимся при тяжелых отравлениях ФОП, относятся пневмонии, поздние интоксикационные психозы и полиневрозы, возникающие через несколько дней с момента отравления.
Достоверно установлены генетические нарушения (повышение эмбриональной смертности и врожденных аномалий у потомства) у лиц, перенесших острые отравления ФОП, и у рабочих промышленных предприятий, подвергающихся хроническому воздействию низких концентраций этих веществ.
Химико-токсикологический анализ ФОП имеет чрезвычайно важное значение для доказательства ФОП, т.к. они, в большинстве случаев, не вызывают каких-либо специфических морфологических изменений в организме человека.
ХТА представляет большую сложность ввиду большого ассортимента ФОП, быстрого метаболизма в организме и образования новых продуктов, а также при изолировании и обнаружении.
Объектами исследования при ХТА могут быть как сами ядохимикаты, так и биологические объекты – желудок с содержимым, печень, почки в смертельных случаях отравления и биологические жидкости – кровь, моча – у живых лиц при установлении диагноза острого отравления, а при санитарно-гигиенических исследованиях – пищевые продукты, почва, вода.
Изолирование из внутренних органов трупа основано на настаивании измельченных органов с 3-х кратным объемом смеси: ацетон-этанол-вода (1,5:1,5:1) при рН 5-5,5 в течение 4 часов с последующим экстрагированием хлороформом.
Изолирование из биологических жидкостей проводят при рН 5 прямой экстракцией хлороформом с последующей концентрацией извлечения.
Обнаружение и определение
Тонкослойная хроматография в анализе ФОП – второй по значимости метод. По сравнению с методом ГЖХ он менее чувствителен и специфичен, не дает точной количественной оценки, но преимущество его в том, что он не требует специальной аппаратуры и, при необходимости, может быть использован в любой лаборатории.
Метод ТСХ используется для очистки и разделения ФОП, идентификации и ориентировочного количественного определения.
Для хроматографирования используют пластины «Silufol», либо стеклянные пластины с силикагелем, фиксированным гипсом. Хроматограммы развивают в одной из систем растворителей: 1. гексан-ацетон 4:1; 2. бензол.
Общая проба на ФОП
На пластину наносят 2 точки метчика с содержанием смеси ФОП 10 и 20 мкг (для ориентировочного количественного определения) и аликвоту извлечения. Хроматографируют в одной из систем, затем проявляют, последовательно обрабатывая пластину:
1. Парами брома – наблюдают буро-коричневые пятна (не специфична, дают соэкстрактивные вещества);
2.Спиртовым раствором железа (III) хлорида и кислоты сульфосалициловой
наблюдают пятна желтого или белого цвета (фосфат-ион).
При положительном результате общей пробы на ФОП устанавливают класс ФОП.
Определение класса ФОП
На три хроматографические пластины наносят аликвоты экстрактов, как в общей пробе. После хроматографирования пластины обрабатывают следующим образом: 1-ю пластину (на серусодержащие ФОП) с палладия хлоридом, наблюдают пятно желтого цвета, либо с серебра нитратом и бромфеноловым синим, при этом наблюдают пятно лилового цвета (после обесцвечивания фона кислотой лимонной).
2-ю пластину (на ФОП с нитрофенильным радикалом) опрыскивают спиртовым раствором едкого натрия. При наличии в пятне свободных нитрофенолов (метаболиты) – желтая окраска появляется сразу, в присутствии ФОП с нитрофенильным радикалом – желтая окраска появляется после нагревания.
3-ю пластину (на хлорофос и дихлофос) обрабатывают щелочным раствором резорцина, наблюдают пятна, окрашенные в розовый цвет.
Пятна, выявленные во всех случаях, сравнивают с пятнами метчика. При совпадении Rf искомого ФОП с Rf метчика выполняют подтверждающие реакции и проводят ориентировочное количественное определение по площади пятна. Содержание ФОП рассчитывают по формуле:
А S² где Х — содержание ФОП в объекте (мкг/кг)
Х = В S¹ А — содержание ФОП в стандарте (мкг)
В — навеска пробы в г с учетом аликвоты
S¹ — площадь пятна метчика (мм 2 )
S² — площадь пятна пробы (мм 2 )
При положительном результате общей пробы на ФОП определяют степень угнетения холинэстеразы крови.
Холинэстеразная проба(энзимное экспозиционно-колориметрическое определение) – основана на способности ФОП угнетать активность фермента холинэстеразы. При угнетении холинэстеразы нарушается регулирование разложения ацетинхолина, что приводит к его накоплению и непрерывному раздражению нервных клеток. Как следствие, нарушаются функции ЦНС и вегетативной НС. Это приводит к тяжелейшим расстройствам — судорогам, параличам, бронхоспазму, угнетению дыхания и сердечной деятельности.
(CH3)3-NCH2CH2OCOCH3 (CH3)3-NCH2CH2OH + HOCOCH3
ацетилхолин холин уксусная кислота
В норме ацетилхолин под влиянием фермента холинэстеразы разрушается с образованием холина и уксусной кислоты, в результате чего изменяется рН смеси ацетилхолин + холинэстераза.
Изменение рН можно зафиксировать с помощью кислотно-основных индикаторов, например, бромтимолового синего. Изменение окраски в контроле (от синей к желтой) происходит в течение 10-15 минут. В присутствии ФОП (как антихолинэстеразных веществ) окраска индикатора не изменяется более продолжительное время, чем в контроле.
Угнетение активности холинэстеразы рассчитывают в % по формуле:
100 Т где Т — время изменения окраски в контрольной пробе
Х = 100 — Т¹ Т¹ — время изменения окраски в исследуемой пробе
Угнетение активности холинэстеразы более чем на 10 %, указывает на возможное присутствие в пробе ФОП.
Экстрактивные вещества органов трупа, крови, мочи без глубокого гнилостного разложения не мешают определению. Продукты гниения могут снижать активность холинэстеразы на 10-50 %. В этом случае проводят предварительную очистку пробы на колонке с активированным углем.
Холинэстеразная проба неспецифична, используется как предварительный, ориентировочный тест, не имеющий отрицательного судебно-химического значения.
Источник
10.4. Схемы изолирования некоторых групп пестицидов из биологических тканей
Основным отличием схем изолирования органических веществ из биотканей (органов) от изолирования из биологических жидкостей является наличие стадии настаивания (извлечения) веществ из твердых тканей печени, почки и др. В качестве извлекателей, как правило, используются малополярные или полярные органические растворители, однако, для изолирования отдельных веществ (хлорофос и др. ФОС) используют водно-ацетоновые смеси. После настаивания вытяжки подвергают очистке от жиров и др. эндогенных веществ методамигрубой очистки — вымораживание, фильтрование. Для тонкой очистки используют несколько вариантов:
1. Очистка в системе гексан (ГК)-ацетонитрил (MeCN). Сухой остаток после упаривания извлекателя или экстрагента обрабатывают гексаном, а затем прибавляютMeCNи встряхивают смесь. После чего слойMeCN(нижний) отделяют, гексановый слой отбрасывают. К ацетонитрильному экстракту прибавляют водный растворNa2SO4и экстрагируют ядохимикаты гексаном. Метод применим при изолировании ФОС, пиретроидов.
2. Сорбционная очистка может включать как адсорбцию целевых компонентов (сорбенты — активированный уголь, ХМК и др.) с последующим элюированием ядохимикатов, так и адсорбцию балластных веществ (полярные сорбенты — силоксид, диатомиты и др.).
Очистка методом ТСХ.
Очистка с использованием концентрированной серной кислоты (для ХОС).
Микровозгонка в вакууме (некоторые ФОС).
Перегонка с водяным паром (ГХЦГ).
После очистки извлечений проводится экстракция (или элюирование) ядохимикатов при помощи органических растворителей или их смесей. Органический экстракт затем упаривают на роторном испарителе (в вакууме), поскольку ФОС, пиретроиды и некоторые другие группы пестицидов легко разлагаются при нагревании в присутствии кислорода или гидролизуются. Затем сухой остаток растворяют в подходящем растворителе и анализируют.
Рассмотрим несколько схем выделения ФОС, пиретроидов и ХОС из биологического материала.
10.5. Извлечение пестицидов из биологических тканей
Схема извлечения ФОС включает настаивание измельченного органа со смесью вода-ацетон (есть варианты — ацетон-гексан, дихлорметан, ацетон, ацетонитрил (см. ниже)), вымораживание жиров, экстракцию хлороформом или гексаном, проведение дополнительной очистки (если необходимо) и анализ.
Похожая схема используется и для изолирования синтетических пиретроидов. Для извлечения используют хлороформ, затем проводят очистку от жиров, экстракцию гексаном, очистку экстракта от эндогенных веществ активированным углем и анализ.
Несколько сложнее проводится извлечение ХОС и ПХБ из жировой ткани. Вначале образец растирают с безводным сульфатом натрия, проводят извлечение гексаном, затем экстракт очищают при помощи концентрированной серной кислоты, отмывают экстракт от серной кислоты, сушат, упаривают и проводят анализ.
10.6. Методы определения пестицидов, выделенных из биоматериала или экологических проб
Для достоверного определения выделенных из биоматериала ядохимикатов в основном применяют два метода — один для обнаружения (например, ТСХ, холинэстеразная проба, иммуноферментный анализ), второй — для подтверждения и количественного определения. Второй метод должен быть более селективным и чувствительным, чем первый. Это чаще всего ГЖХ с селективными детекторами, ГХ/МС, реже фотометрия и ВЭЖХ. При анализе технических жидкостей используют также химический метод — элементный анализ и качественные реакции.
Химические методы анализа ядохимикатов. Эта группа методов включает элементный анализ (обнаружение атомов галогена, серы, фосфора или азота в органических веществах) и реакции качественного обнаружения (реакции на функциональные группы, реакции окрашивания с концентрированными кислотами или щелочами, реакции, используемые для проявления пестицидов после ТСХ-разделения). Химические методы чаще всего используют при анализе неизвестных образцов технических препаратов ядохимикатов, значительно реже – при судебно-химическом исследовании органов трупа (очевидно, из-за невысокой чувствительности и селективности этих методов).
Элементный анализ основан на разрушении молекулы органического (или элементорганического) вещества при действии различных химических (щелочные металлы, оксиды металлов, концентрированные кислоты и др.) и физических (нагревание) воздействий с последующим обнаружением соединения, содержащего анализируемый элемент.
По результатам элементного анализа можно определить групповую принадлежность пестицида. Например, если обнаружено наличие фосфора и доказано отсутствие хлора, то можно сделать вывод, что данный ядохимикат не относится к хлорорганическим соединениям, а относится к органическим соединениям фосфора.
Соединения, которые подвергаются элементному анализу должны быть достаточно чистыми, перед проведением анализа их следует освободить от примесей.
Обнаружение фосфора: обнаружение складывается из двух этапов: минерализация (разрушение молекулы исследуемого вещества и переведение фосфора вPO4 3- ) и обнаружениеPO4 3- в минерализате.
Известно несколько способов минерализации, используемых при обнаружении фосфора:
минерализация с СаО:в платиновый тигель вносят немного СаО и несколько капель раствора исследуемого вещества. Смесь нагревают до выпаривания жидкости. Если анализируют твёрдое вещество, то его вносят в тигель и прибавляют СаО. После этого тигель постепенно нагревают на небольшом пламени газовой горелки, затем увеличивают пламя и продолжают нагревать до красного каления тигля. Затем тигель охлаждают и его содержимое растворяют в нескольких мл 2 М раствора азотной кислоты.
минерализация с карбонатом и пероксидом натрия:в платиновый или никелевый тигель вносят немного смеси, приготовленной из 0,2 г безводногоNa2CO3 и 0,5 гNa2O2, и небольшое количество исследуемого вещества (либо несколько капель раствора или вытяжки). Тигель осторожно нагревают до испарения жидкости. Затем увеличивают пламя и нагревают до расплавления смеси. Затем тигель охлаждают, его содержимое переносят в небольшую фарфоровую чашку, прибавляют немного карбоната натрия, 10 мл воды. Смесь тщательно растирают.
Перед обнаружением фосфат – ионов в минерализате из него необходимо предварительно удалить ионы AsO4 — , которые дают сходные реакции и мешают проведению анализа. Для этого минерализат подкисляют хлороводородной кислотой до рН
0,5 и пропускают сероводород. Выделившийся осадок (As2S3+S) отфильтровывают. Арсенат-ионы можно также перевести в арсенит-ионы (добавлением сульфита натрия), которые не мешают обнаружению фосфата.
Для обнаружения фосфат-ионов используют реакцию образования молибденовой сини:
К образовавшемуся осадку жёлтого цвета добавляют восстановитель (бензидин, аскорбиновая кислота и т.п.). Появляется синее окрашивание.
Обнаружение азота:исследуемое соединение минерализуют сплавлением с металлическим натрием или калием по Лассеню. Цианид-ионы обнаруживают по реакции образования берлинской лазури или бензидиновой сини.
Если в молекуле вещества присутствуют одновременно азот и сера, то при минерализации образуются роданид-ионы, которые можно обнаружить по реакции образования красного роданида железа (III).
Обнаружение серы:при сплавлении исследуемого вещества со щелочными металлами образуется ионыS 2- , которые затем обнаруживают реакциями с хлоридом кадмия, нитропруссидом.
При сплавлении исследуемого вещества со смесью карбоната и пероксида натрия сера, входящая в состав его молекулы, окисляется до сульфат-иона, который можно затем обнаружить с солями бария.
Обнаружение хлора: органически связанный хлор переводят с помощью различных реагентов в ионное состояние и затем обнаруживают его в минерализате реакцией с нитритом серебра.
Для перевода хлора, содержащегося в молекуле исследуемого вещества, в хлорид-ион используют:
— сплавление с металлическим натрием или калием;
— взаимодействие с натрием и этанолом;
— нагревание со смесью азотной и серной кислот;
— нагревание со смесью дихромата калия и серной кислотой и др.
Химические реакции качественного обнаружения ядохимикатов в настоящее время актуальны при визуализации разделенных соединений на пластинах ТСХ. Среди наиболее употребляемых реактивов следует отметить о-толидиновый реактив (проявление ФОС), аммиачный раствор нитрата серебра с последующим облучением УФ-светом (проявление ХОС, синтетических пиретроидов, группы 2,4-Д и др.).
Широкое использование хроматографических методов в анализе пестицидов требует более подробного их рассмотрения.
1. ТСХ—анализ состоит изследующих этапов: нанесение пробы и стандартных веществ на пластину, элюирование (разделение) в камере с подвижной фазой, высушивание пластины, проявление разделенных компонентов, расчет величин удерживания (Rf), идентификация веществ. В качестве подвижных фаз для разделения ядохимикатов в тонких слоях силикагеля используют смеси органических растворителей — гексан-ацетон в различных соотношениях, толуол-ацетон, смеси хлороформа, гексана, ацетонитрила и др. Как уже отмечалось, для проявления ХОС, пиретроидов используют раствор нитрата серебра с последующим облучением УФ-светом. Для проявления ФОС используют обработку бромфеноловым синим и раствором лимонной кислоты, а также о-толидиновый реактив.
2. ГЖХ. Ядохимикаты в большинстве своем являются высококипящими жидкостями или твердыми веществами, поэтому для их разделения в ГХ используют термостойкие НЖФ — силиконовые фазы, реже — эфиры полиэтиленгликоля или ПЭГ-20000. В таблице1приведены некоторые типичные условия ГХ-определения некоторых ядохимикатов.
Таблица. Условия газохроматографического определения некоторых пестицидов
Источник
