Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Физик-химические св-ва белков
Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются: высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление.
Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2-и СООН-групп и характеризуются соответственно всеми свойствами кислот и оснований. Белки обладают гидрофильными свойствами. Их растворы обладают очень низким осмотическим давлением, высокой вязкостью и незначительной способностью к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. Денатурация белка- под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Большинство белков денатурируют при нагревании их раствором выше 50-60о С.
6) Методы синтеза аминокислот и пептидов.
1) Аммонолиз галогензамещенных кислот. Метод используется для синтеза a -аминокислот из доступных a -галогензамещенных кислот.
2) Метод Штеккера- Зелинского. Включает стадии образования аминонитрила при
взаимодействии альдегида с HCN и NH3 c последующим гидролизом его в аминокислоту. В качестве
реагента применяют смесь NaCN и NH4Cl. Метод применим для синтеза только a -аминокислот.
3) Восстановительное аминирование оксокислот
4) Присоединение аммиака к a ,b -непредельным карбоновым кислотам.Метод применим для синтеза b -аминокислот.
5) Из оксимов циклических кетонов перегруппировкой Бекмана.Метод используется для синтеза w -аминокислот.
7)Первичная структура белков. Под первичной структурой понимают последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи
Методы определения первичной структуры белка
Деградация по Эдмону
К раствору белка добавляют реактив Эдмона, содержащий фенилизотиоцианат.
Фенилизотиоцианат взаимодействует с альфа-аминогруппой первой (N-концевой) аминокислоты, а затем происходит ее отщепление от полипептидной цепи путем гидролиза: После этого идентифицируют первую аминокислоту. Затем процесс повторяется.
В настоящее время процесс автоматизирован.
Секвенирование ДНК
Первичная структура любой белковой молекулы напрямую зависит от структуры ДНК-генома. Поэтому сначала выделяют ген, в котором закодирована структура белка. Далее определяют последовательность азотистых оснований в ДНК. Каждая аминокислота в белковой молекуле закодирована сочетанием трех азотистых оснований — триплетом (кодоном) в молекуле ДНК. Например, сочетание трех оснований аденина (ААА) кодирует аминокислоту фенилаланин, а последовательность из трех оснований цитозина – глицин. Это дает возможность получить информацию о первичной структуре белковой молекуле, а, значит, прогнозировать строение всей молекулы в целом, поскольку именно первичная структура определяет строение всех высших уровней организации – и вторичной, и третичной, а, иногда и четвертичной структур.
Для проверки предположений о строении высших структур используется еще один метод:
Рентгеноструктурный анализ
Схема, поясняющая принцип этого метода, представлена на рисунке:
В результате облучения на фотопленке фиксируется карта электронной плотности (похожа на географическую карту). Далее производится компьютерный анализ полученного изображения, в результате чего строится пространственная модель белковой молекулы.
Электронная микроскопия
Может быть использована для выяснения структуры белковых молекул с большой молекулярной массой – от 500.000 до 1.000.000 Да (дальтон). Дальтон (Да) и килодальтон (кДа) – единицы измерения массы белков. 1кДа=10 3 Да. 1 дальтон равен 1/16 массы атома кислорода (кислородная единица массы).
8) Методы фракционирования белков. Изоэлектрическая точка. Филлипович 28
После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.
Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов.
Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.
В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элементы, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).
Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка.
Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.
Метод кристаллизациибелков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.
Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.
Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несётэлектрического заряда. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА (ИЭТ). 1. Характеристика состояния р-ра амфотерного электролита (амфолита) -соед., способного присоединять или отщеплять протоны, превращаясь либо в положительно, либо в отрицательно заряженные ионы, — при к-ром суммарный электрич. заряд амфолита равен нулю. В ИЭТ амфолит не перемещается в электрич. поле. Соответствует рН р-ра, при к-ром одинаковы концентрации положительно и отрицательно заряженных форм (напр., для аминокислот) или числа ионизированных кислотных и основных групп (напр., для макромолекул белков и др. полиамфолитов).
9) Классификация белков в значительной мере условна и построена на различных, часто случайных, признаках. Белки разделяют на животные, растительные и бактериальные, на фибриллярные и глобулярные, мышечные, нервной ткани и т. п. Учитывая исключительное многообразие белков, ни одну классификацию нельзя считать удовлетворительной, поскольку многие индивидуальные белки не подходят ни к одной группе. Обычно принято делить Б. на простые (протеины), состоящие только из остатков аминокислот, и сложные (протеиды), содержащие также простетические (небелковые) группы.
I. Простые белки (протеины).
Альбумины — глобулярные белки. Растворимы в чистой воде и солевых растворах. Осаждаются при насыщении раствора сернокислым аммонием. Типичные представители: яичный альбумин, альбумин сыворотки крови (см. Альбумины).
Глобулины— глобулярные белки, но более высокого молекулярного веса. Растворимы в разведенных растворах солей, не растворимы в чистой воде. Осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония. К этой группе относятся глобулины сыворотки крови, молока, эдестин конопли и ряд других животных и растительных Б. (см. Глобулины).
Проламины (глиадины) — белки семян злаков. Растворимы в 70—80% спирте и не растворимы в воде. Относительно богаты пролином и глютаминовой кислотой. Типичные представители: глиадин пшеницы, гордеин ячменя, зеин кукурузы.
Глютелины — белки злаков. Растворимы в разведенных кислотах или щелочах, но не в нейтральных растворах.
Склеропротеины (альбуминоиды, протеиноиды) — нерастворимые в воде, солевых растворах, разведенных кислотах и щелочах Б., главным образом животного происхождения, несущие структурные (чаще опорные) функции. Склеропротеины — обычно фибриллярные белки, весьма устойчивые к действию пищеварительных ферментов. К ним относятся фибриллярные Б. соединительной ткани, коллагены, содержащиеся в костях, коже, сухожилиях. Для коллагенов характерно образование при нагревании с водой желатины, которая застывает в гель при охлаждении, плавится при нагревании. Коллагены содержат много пролина и особенно оксипролина. Другую группу соединительнотканных Б. представляют эластины. К склеропротеинам относятся также кератины волос, шерсти, богатые цистином, и фиброины шелка, паутины и т. п.
Протамины— Б. основного характера, содержащиеся в сперме некоторых рыб и других животных в виде комплексов с ДНК. Имеют сравнительно небольшой мол. вес, содержат очень много аргинина и немного некоторых моноаминомонокарбоновых кислот. Иногда в их состав входят лизин и гистидин. Наиболее изучены клупеин (протамин из спермы сельди), сальмин (из спермы лосося).
Гистоны — Б. менее выраженного основного характера, богатые диаминомонокарбоновыми кислотами. Входят в состав нуклеопротеидов клеточных ядер.
II. Сложные белки (протеиды).
Нуклеопротеиды — комплексы Б. с нуклеиновыми кислотами .Имеют очень высокий молекулярный вес. Играют важнейшую роль в биосинтезе Б. в организме, в передаче наследственных признаков и т. п.
Мукопротеиды— белки, содержащие мукополисахариды — углеводные группировки кислого характера (муцины, мукоиды). Содержатся главным образом в слизях, слюне, синовиальной жидкости и т. п.
Фосфопротеидысодержат фосфорную кислоту, обычно в виде сложного эфира с оксигруппой серина. Главные представители: казеин молока, вителлин яичного желтка
Металлопротеиды— комплексы белков с металлами или органическими группировками, содержащими атомы металлов. К ним относятся многие хромопротеиды (Б., содержащие окрашенные группировки), например гемоглобин (см.) и другие пигменты крови, многие ферменты, например оксидазы, содержащие железо или медь, и др.
Липопротеиды — комплексы Б. с различными липидами. В крови играют большую роль в переносе липидов. Входят в состав клеточных оболочек и внутренних мембран клеточных структур
Источник
Очистка белков от низкомолекулярных примесей
Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.
Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.
Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации(см. выше) и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их. Если подобрать мембрану с таким размером пор, что через нее будут проходить не очень крупные белки, а большие белковые молекулы будут задерживаться, то ультрафильтрация может служить для фракционирования белков.
Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.
Источник
