Способы обнаружения спор микроорганизмов
Жгутики бактерий очень тонки и легко отрываются. Поэтому обнаружить их можно только при специальной окраске или с помощью электронного микроскопа.
Выявить жгутики у бактерий, применив обычные способы окраски анилиновыми красителями невозможно.
Жгутики, как правило, становятся видимы, если препарат предварительно обработать протравой, а потом окрасить. Протравленный препарат легче воспринимает окраску, но самое главное то, что жгутики при осаждении на них протравы увеличиваются и становятся видимыми при микроскопировании.
Существуют разные способы окраски жгутиков, но в каждом отдельном случае в зависимости от индивидуальных свойств микробов приходится выбирать тот или иной способ.
Для успешной окраски жгутиков должны соблюдаться следующие условия:
1. Чистота предметных и покровных стекол должна быть идеальной.
2. Препарат должен готовиться из свежей агаровой суспензии культуры не старше суточной, а для некоторых видов (вибрион, сенная палочка) не старше 12 часов. Часть материала, взятую из посевной черты (ближе к конденсационной воде), где больше влаги переносят в пробирку с 1 – 2 мл стерильной водопроводной воды. Пробирки выдерживают 30 60 минут при комнатной температуре, затем взвесь бактерий переносится в каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора, нанесенную на покровное стекло. При распределении материала на покровном стеклышке, надо соблюдать осторожность, чтобы механически не повредить жгутики инее оторвать их от тела бактерий.
Мазок должен быть тонким, чтобы особи могли расположиться изолировано друг от друга.
Воду на стекле следует распределять тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата и уменьшить потерю жгутиков.
Наиболее часто для окрашивания жгутиков используют способ Леффлера (Loffler). Методика окраски:
1. На высушенный и зафиксированный мазок наливают протраву в таком количестве, чтобы покрыть всю поверхность покровного стеклышка, и выдерживают 3 – 5 минут при комнатной температуре.
2. По истечении указанного времени препарат осторожно и тщательно промывают проточной водой.
3. На препарат наносят раствор фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды) и препарат прогревают над пламенем до появления пара.
4. Препарат промывают водой и микроскопируют.
Приготовление протравы для выявления жгутиков бактерий:
12г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды и к этому раствору прибавляют 30 мл насыщенного раствора фуксина в 95% этиловом спирте. Раствор отфильтровывают и хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Протрава готова к употреблению через несколько дней после приготовления и может сохраняться в течение нескольких месяцев.
Для обнаружения жгутиков у простейших препараты можно окрашивать простым способом, используя метиловый синий, раствор Люголя или сложным методом по Романовскому – Гимза.
Выявление капсул у бактерий
Капсулы не обладают выраженным сродством к основным красителям, поэтому для обнаружения капсул применяют различные способы приготовления микропрепаратов и их окраски, учитывая особенности образования и сохранения капсул у разных видов бактерий.
Для обнаружения капсулы необходимо наличие окрашенного внутри капсулы фона и окрашенного наружного фона.
Внутренний фон представлен окрашенной микробной клеткой, находящейся внутри капсулы. А наружный фон, окружающий капсулу, может быть естественным или искусственным.
Если микроб сохраняет капсулу постоянно, т.е. не только внутри макроорганизма, но и на питательной среде (клебсиеллы), то препарат для обнаружения капсул можно приготовить из культуры, выращенной in vitro на питательной среде. И в таком случае наружный фон создается искусственно.
Если микроб образует и сохраняет капсулу только внутри макроорганизма (возбудители сибирской язвы, чумы, пневмококки), то в таком случае делается мазок – отпечаток из пораженного органа погибшего макроорганизма (из печени, селезенки, лимфатических узлов) или из мокроты, содержимого бубона, крови. Наружный фон капсулы будет представлен тканевыми клетками.
Микропрепарат из культуры клебсиелл для обнаружения у них капсулы можно окрасить по методу Бурри – Гинса:
1. На чистое предметное стекло наносится небольшая капля черной туши и капля взвеси суточной агаровой культуры капсульных бактерий. Смесь осторожно перемешивается петлей , после чего другим предметным стеклом делается мазок, подобно мазку крови.
2. После подсушивания на воздухе и фиксации в пламени горелки препарат докрашивают в течение 2 – 3 минут карболовым фуксином Циля, разбавленным дистиллированной водой 1:1.
3. По окончании препарат осторожно промывается струей холодной воды, высушивается и микроскопируется. На темном тушевом фоне будут видны окрашенные микробные клетки окруженные бесцветной капсулой. При отсутствии капсулы, к клетке окрашенной фуксином, черный фон примыкает вплотную.
В том случае, если микропрепарат готовится из исследуемого материала, мазок может быть окрашен одним анилиновым красителем, по методу Грамма, по методу Романовскго – Гимза. В каждом из этих трех споосбов окраски на фоне окрашенных тканевых клеток, будет видна бесцветная капсула, окружающая окрашенную микробную клетку. Обнаружение спор.
Благодаря толщине свое оболочки и плотности содержимого, споры остаются неокрашенными при обработке препарата анилиновыми красителями простым методом или сложным по Граму.
При окраске по Граму или по Леффлеру спора внутри окрашенной цитоплазмы микробной клетки выглядит как зернышко круглой или овальной формы, сильно преломляющее свет.
Существует несколько методов окраски спор (по Циль – Нильсену, по Ганзену, по Ожешко и др.) позволяющих достигнуть контрастной окраски спор в цитоплазме.
Методика окраски микропрепарата:
1) На фиксированный препарат накладывается полоска фильтровальной бумаги (для защиты препарата от оседающих кристаллов красителя) и на нее наливается карболовый фуксин Циля. Препарат осторожно прогревается в течение 3 – 4 минут над пламенем горелки. По мере испарения жидкости краситель добавляется.
2) Фильтровальная бумага снимается и на мазок наносится 2 – 3 капли 5% раствора кислоты (серной, соляной, азотной или уксусной) на 30 секунд.
3) Препарат тщательно промывается струей холодной воды и высушивается.
4) Докрашивается раствором метиленовой сини Леффлера в течение 1 – 2 минут.
5) Препарат промывается струей воды, высушивается и микроскопируется. На голубом фоне цитоплазмы видны сиренево – красные споры.
Этот метод позволяет обнаружить споры не только в процессе их формирования внутри клетки, но и после того как сформированная спора высыпалась из разрушившейся микробной клетки.
Приготовление карболового фуксина Циля:
10 мл. насыщенного спиртового раствора фуксина растворяют в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.
Обнаружение зерен волютина
Зерна волютина (запасные вещества полифосфатной природы) можно обнаружить в клетках многих микроорганизмов.
У бактерий и актиномицетов гранулы волютина располагаются в цитоплазме, у дрожжей и грибов – в вакуолях. Как правило, зерен волютина больше в молодых клетках.
В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью.. Однако лучше наличие зерен волютина определяется в окрашенных препаратах. Для обнаружения зерен волютина применяется окраска метиловой синью по Леффлеру. Зерна волютина при этом окрашиваются в сине – фиолетовый цвет, а протоплазма – в голубой.
Дифференциальная окраска зерен волютина может быть достигнута различными способами окраски, в том числе и способом Нейссера (Neisser). Нейссер разработал и предложил для выявления зерен волютина в клетках дифтерийных бактерий.
При окраске по способу Нейссера зерна волютина окрашиваются в синий или темно – коричневый цвет, а протоплазма – в светло – коричневый.
Зерна волютина можно выявить окраской по способу Омелянского. Для этого на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 30 секунд. После чего краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 30 – 40 секунд 1% раствором серной кислоты. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и докрашивают метиловым синим в разведении 1:40 в течение 30 секунд. После промывки водой препарат высушивают и микроскопируют.
Зерна волютина при этом способе окраски окрашиваются в сиренево – красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.
При окраске препарата по методу Грама зерна волютина по тональности и интенсивности окраски не дифференцируются от цитоплазмы, поэтому окраску по методу Грама для выявления зерен волютина применять не имеет смысла.
У некоторых микроорганизмов запасные вещества накапливаются в виде гранул углеводной природы. Их можно выявить при обработке клеток раствором Люголя. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов – в красновато – коричневый цвет.
Окрашивание микропрепаратов из исследуемого материала
Микропрепараты из крови окрашивают по Романовскому – Гимза, фуксином, метиловым синим или другими анилиновыми красителями.
Для наблюдения вегетативных стадий кишечных простейших пользуются прижизненной окраской паразитов раствором Люголя, слабыми растворами основных красителей (эозин, метиловый синий и др.) в разведении 1:1000 и даже 1: 10000. Для более подробного изучения паразитов, препараты фиксируют жидкими фиксаторами (жидкость Шаудина, метиловый или этиловый спирт) и окрашивают гематоксилином, метиловым синим, фуксином, краской Романовского.
При микроскопическом исследовании мазков мочи, спинномозговой жидкости, мокроты фиксированные препараты окрашивают по Граму, по Романовскому — Гимза, метиловым синим
Фиксированные микропрепараты из гнойного содержимого язв, пунктатов бубонов, лимфатических узлов в зависимости от предполагаемого возбудителя окрашивают по Граму, по Бури, по Романовскому – Гимза, серебрением по Морозову.
Источник
Вопрос (Капсула бактерий, ее биологическая роль, способ обнаружения).
Капсула образуется только в организме человека и животных. Это слизистый слой, толщиной 0,2 мкм, имеющий четко очерченные внешние границы.
По химическому составу различают:
—капсулы, состоящие из полисахаридов, не содержащих азот
— капсулы, состоящие из полисахаридов, содержащих азот
— капсулы полипептидной природы (сибиреязвенные бациллы)
Капсула гидрофильна и включает большое количество воды. Многие бактерии образуют микрокапсулу –вокруг одной бактериальной клетки, выявляется при электронной микроскопии в виде микрофибрилл из мукополисахаридов, которые прилегают к клеточной стенке (чумная палочка). Макрокапсула – вокруг нескольких бактериальных клеток, выражен слизистый слой, снаружи покрывающий клеточную стенку (пневмококк, сибиреязвенные бациллы).
Функции капсулы:
1. препятствует фагоцитозу бактерий, действию бактериофагов
2. защита от высыхания
3. адгезивная – способствует прилипанию к поверхности клетки хозяина
4. определяет антигенную специфичность и иммуногенные свойства.
Капсула, в связи с гелеобразной консистенцией, плохо удерживает красители, поэтому для ее обнаружения используют метод негативного контрастирования, например, по Бури-Гинсу:
1. На середину предметного стекла наносят капельку черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли.
2. краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.
3. Окрашивают 5 минут карболовым фуксином, разведенным водой 1:3
4. осторожно промывают водой, высушивают.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.
10 вопрос (Спорообразование у микробов, биороль. Способ окраски спор).
Споры – это покоящиеся клетки с грамположительным типом строения клеточной стенки. У них низкая метаболическая активность. Образуются при неблагоприятных условиях окружающей среды. Внутри клетки образуется одна спора (эндоспора). Спора способствует сохранению вида и не является способом размножения. Споры обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. По диаметру споры могут быть больше (клостридии) и меньше (бациллы) вегетативных микроорганизмов.
Споры могут располагаться:
— центрально (сибиреязвенная бацилла)
— терминально (клостридия столбняка)
— субтерминально (клостридия ботулизма)
Стадии спорообразования:
1. подготовительная — в одном из участков клетки цитоплазма с частью нуклеоида уплотняется.
2. Проспора – цитоплазматическая мембрана врастает в цитоплазму и окружает уплотнившийся участок
3. Образование оболочки – между двумя мембранами, покрывающими проспору, формируется толстый слой кортекса (кора).
4. созревание – остальная часть клетки отмирает, формируется зрелая спора с плохо проницаемой многослойной оболочкой.
5. весь процесс занимает 18-20 часов.
Прорастание спор включает три стадии:
1. Активация – осуществляется различными воздействиями (кислая рН, свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическими повреждениями)
2. Начальная стадия – активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, спора высвобождается от дипиколината кальция, разрушаются другие компоненты.
3. Стадия роста – появляется ростовая трубка, из которой вырастая новая вегетативная клетка
4. процесс прорастания занимает 5-6 часов.
Методы обнаружения спор:
1. фиксированный мазок покрывают полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогревают над пламенем горелки до появления паров, каждый раз подливая краситель
2. Бумагу снимают и обесцвечивают мазок в 5% растворе серной кислоты, затем промывают водой
3. на мазок наливабт раствор метиленового синего на 3-5 мин
4. препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.
5. споры окрашиваются в красный цвет
Окраска по Ожешки:
1. на нефиксированный мазок 0,5% р-р соляной кислоты
2. подогревают на пламени горелки 2-3 мин
3. кислоту слить
4. препарат промыть водой
7. окраска по Цилю-Нильсена
8. Споры – красный цвет.
11 вопрос (Жгутики бактерий, их обнаружение (биологическая роль, расположение, химический состав).
Жгутики – очень тонкие органы движения. Состоят из сократительного белка флагеллина на 98%. Жгутики связаны с телом бактерий при помощи 2-х дисков:
— наружный находится в клеточной стенке
— внутренний – в цитоплазматической мембране.
Жгутик состоит из трех компонентов – спиральная нить, крючок, базальное тельце и стержень со специальными дисками (1 пара дисков – у грамположительных бактерий, 2 пара – у грамотрицательных).
Классификация:
1. монотрихи – один жгутик на конце (холерный вибрион)
2. амфитрихи – по одному жгутику с разных концов (спирилла)
3. лофотрихи – пучок жгутиков на конце (псевдомонада)
4. перитрихи – жгутики по всей поверхности (сальмонелла, кишечная палочка).
Методы обнаружения жгутиков:
1. метод серебрения по Морозову (окрашиваются в темно-коричневый цвет)
2. метод Леффлера (окрашиваются в красный цвет фуксином Циля)
3. электронная микроскопия
12 вопрос (Отличительные черты строения Грам + и Грам — бактерий. Окраска по Граму (техника).
Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет наиболее простое строение. Структура ее однородна, она толще (10—15 нм), чем клеточная стенка грамотрицательных бактерий. Основная масса клеточной стенки — гликопептиды (до 90%). Сеть микрофибрилл погружена в матрикс, содержащий полисахариды (до 90%) и тейхоевые кислоты. Белки обычно отсутствуют, а липиды составляют всего 2,5%. Однако некоторые грамположительные бактерии, например коринебактерии и микобактерии, содержат в клеточной стенке большое количество липидов. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет сложное строение и по химическому составу значительно отличается от клеточных стенок грамположительных бактерий. Внутренний слой клеточной стенки — тонкий мешочек молекул гликопептида, состоящий из одного или двух молекулярных слоев (2—3 нм). Поверх него лежит широкий внешний слой (7—8 нм) из неплотно упакованных молекул белка и фосфолипидов, над которым располагается третий слой — липополисахариды. Возможна и другая структура внешнего слоя клеточной стенки: в двойной слой фосфолипидов включены белки и липополисахариды.
Окраска по Грамму:На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты. Снимают бумагу и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту, обесцвечивая препарат в 96% спирте в течение 30 секунд. Промывают водой. Красят 1-2 минуты водным раствором фуксина. Ополаскивают водой и высушивают. В результате окраски грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый, грамотрицательные – в красный.
13 вопрос (Строение и способы изучения актиномицетов).
Актиномицеты, или лучистые грибы, — низшие растительные организмы, широко распространенные в природе, особенно в почвах, богатых органическими веществами. Многие актиномицеты имеют промышленное значение для получения антибиотиков, участвуют в круговороте веществ в природе. Известны актиномицеты, вызывающие заболевания у человека и животных. Актиномицеты имеют форму тонкой длинной ветвящейся нити, напоминающей гифы грибов, диаметром 0,2—1 мкм, иногда значительной длины.
Актиномицеты обладают некоторыми признаками, общими как с бактериями, так и с грибами. Как бактерии они содержат нуклеоид, состоят из одной клетки, покрытой оболочкой, грамположительны. В то же время они имеют форму ветвящейся нити, которая характерна для нитевидных грибов. Нити актиномицетов, переплетаясь, как и грибы, образуют видимый глазом мицелий. Часть актиномицетов (стрептомицеты) размножается спорами, поэтому они занимают как бы промежуточное положение между бактериями и грибами. По классификации Берджи актиномицеты выделены в самостоятельную группу 17, порядок Actinomycetales, в который входят три семейства.
Семейство Actinomycetaceae. Нитевидные клетки актиномицетов часто распадаются на отдельные фрагменты, напоминающие бациллы. Размножаются они путем фрагментации нитей, спор не образуют. Большинство актиномицетов — сапрофиты, живущие за счет разложения органических веществ в почве. Нокардии могут вызывать сходные с туберкулезом заболевания человека и животных — нокардиозы, а актиномицеты — актиномикозы.
Семейство Streptomycetaceae. Имеют наибольшее сходство с грибами. Образуют длинный разветвленный воздушный мицелий, состоящий из тонких нефрагментированных нитей. Размножаются спорами-конидиями, которые образуются на вершине отдельных нитей-конидиофоров. Конидии менее термоустойчивы, чем споры бактерий, и гибнут при 65°С через 10 — 3О мин. Большинство стрептомицетов играет активную роль в разложении разнообразных органических остатков в почве. Представители стрептомицетов являются продуцентами антибиотика стрептомицина. Некоторые из них вызывают заболевания животных и сельскохозяйственных растений.
Семейство Mycobacterium. В патологии человека наиболее важную роль играют микроорганизмы рода Myco-bacterium. Микобактерии могут образовывать слабоветвящийся короткий мицелий, склонный к распаду на отдельные фрагменты. Чаще микобактерии имеют вид палочек, поэтому их относят к истинным бактериям. Размножаются они поперечным делением. Среди микобактерий имеются возбудители очень тяжелых заболеваний человека: туберкулеза и лепры (проказа).
Обычно Актиномицеты окрашиваются простыми методами или по Грамму:
На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты. Снимают бумагу и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту, обесцвечивая препарат в 96% спирте в течение 30 секунд. Промывают водой. Красят 1-2 минуты водным раствором фуксина. Ополаскивают водой и высушивают. В результате окраски грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый, грамотрицательные – в красный.
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.
Источник
