Гистохимия: методы Гистохимические методы: введение Буферные растворы и их приготовление Выявление нуклеиновых кислот Выявление (суммарное) белков Гистохимические методы для полисахаридов и протеидов Окрашивание жиров и липидов Металлы, анионы, экзогенные пигменты Гистохимия ферментов Гистохимия нервной системы
Выявление нуклеиновых кислот
Нуклеиновые кислоты (высокомолекулярные соединения сложного химического состава) играют чрезвычайно важную роль в обеспечении жизнедеятельности любой животной и растительной клетки. Рибонуклеиновая кислота (РНК) осуществляет синтез белков, а дезоксирибонуклеиновая (ДНК) — хранение и передачу наследственных признаков. Первая содержится в цитоплазме и ядрышках, вторая — в хроматине ядер. Столь важная роль нуклеиновых кислот является причиной большого интереса к изучению их содержания и распространения в органах и тканях организма. Существует несколько способов гистохимического выявления нуклеиновых кислот, но наибольшее распространение получил метод Браше (для выявления РНК) и метод Фельгена (для выявления ДНК).
Выявление РНК по методу Браше
(фиксаторы могут быть различные, но наилучшие Карнуа,
Бродского и Ценкера; заливка в парафин)
В настоящее время этот метод во многом утратил свое былое важное значение в связи с тем, что результат реакции не поддается количественной оценке на цитоспектрофотомётре. Вместе с тем данный метод еще довольно широко применяется в лабораториях (особенно, где нет цитоспектрофотометров) и само его освоение дает навык лаборанту в приготовлении и очистке химических растворов.
Сущность метода заключается в избирательном присоединении некоторых основных красителей к нуклеиновым кислотам (при настоящем методе — пиронина к РНК и метилового зеленого к ДНК).
Прежде чем приступить к гистохимической реакции, необходимо произвести очистку метилового зеленого, так как имеющийся в продаже препарат всегда содержит примесь метилового фиолетового, значительно искажающего результат окраски. Для этого к водному раствору метилового зеленого добавляют хлороформ (или амиловый спирт) и, закрыв сосуд, энергично встряхивают. После того как смесь отстоится, в ней отчетливо видны два слоя — темный верхний, представляющий водный раствор красителя, и нижний фиолетовый — хлороформ, окрашенный метиловым фиолетовым. Слив осторожно водный раствор, к нему вновь добавляют хлороформ и повторяют всю процедуру. Отмывание производят до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться в фиолетовый цвет. Очищенный и высушенный препарат может храниться длительное время.
Перед употреблением сливают равные объемы растворов А и Б (хранить не более недели).
1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2. Поместить в раствор метилового зеленого — пиронина (от 100 мин до 20 ч).
3. Промыть в течение нескольких секунд в дистиллированной воде (увеличение сроков промывки приводит к вымыванию пиронина).
4. Высушить фильтровальной бумагой.
5. Быстро провести через абсолютный ацетон, смесь из равных частей ацетона и ксилола, 10% раствор ацетона в ксилоле.
6. Просветлить в двух порциях ксилола и заключить в бальзам.
Результат. РНК ядрышек и цитоплазмы ярко-красного цвета, хроматин ядер зеленый или сине-зеленый.
В целях проверки специфичности окрашивания на РНК ставят параллельно контрольную гистохимическую реакцию. Для этого путем специальной обработки из срезов удаляют РНК, после чего производят окрашивание метиловым зеленым — пиронином по описанной выше схеме.
Результат. Окраска пиронином не происходит, метиловым зеленым — ослаблена.
Наилучшим способом удаления РНК является обработка срезов ферментом рибонуклеазой (0,1—0,5 мг кристаллической рибонуклеазы в 1 мл дистиллированной воды) в течение 2—3 ч при 56°С.
Приотсутствии рибонуклеазы можно произвести экстракцию РНК, помещая срезы в 10 % раствор холодной хлорной кислоты (HCIO4) на 3-4 ч.
Выявление ДНК по методу Фельгена
(фиксаторф различные, но лучше Карнуа, Ценкера; заливка в парафин)
Сущность метода заключается в том, что продукты расщепления молекулы ДНК, осуществляемого в слабокислой среде, взаимодействия с бесцветной фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа ), образует комплекс, обладающий пурпурной окраской. Таким образом, локализация продукта гистохимической реакции указывает местонахождение ДНК, а интенсивность окраски- ее концентрацию.
Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, периодически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипячение в течение 5 мин. Затем охладив содержимое до 50°С, раствор фильтруют, добавляют 20 мл 1N раствора НСI и охлаждают до 25°С, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na2S2O5 ) или калия (K2S2O5) и оставляют в темноте. Через 18—24 ч в раствор всыпают 2г активированного угля, встряхивают в течение 1 мин, отфильтровывают и хранят в темноте при 0—4°С. Готовый реактив Шиффа бесцветен или имеет светло-желтую окраску. Покраснение раствора в процессе хранения свидетельствует о его разложении и непригодности к употреблению.
Необходимо иметь в виду, что иногда в продажу поступает недостаточно очищенный основной фуксин. Поэтому если приготовленный раствор не отвечает предъявляемым требованиям, нужно взять основной фуксин из новой партии и вновь приготовить реактив.
К 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,19) добавляют 90 мл дистиллированной воды. Раствор может храниться длительное время.
Сернистокислая вода для промывки срезов.
К 5 мл 10% бисульфита калия (K2S2O5 ) добавляют 5 мл 1N раствора НСI и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Раствор бисульфита калия можно применять в течение 7 дней, сернистокислую же воду готовят перед употреблением и применяют однократно.
1. Парафиновые срезы толщиной 5—7 мкм депарафинировать и довести до воды.
2. Быстро ополоснуть в холодной 1N HC1.
3. Поместить в 1N HC1 при 60°С на 6мин (стаканчик ставят в водяную баню).
4. Быстро ополоснуть в холодной 1N HC1, а затем в дистиллированной воде.
5. Поместить в реактив Шиффа на 40—60 мин.
6. Осушить фильтровальной бумагой и ополоснуть в трех порциях свежеприготовленной сернистокислой воды по 1—2 мин в каждой.
7. Промыть в водопроводной воде до 10 мин (если нужно докрасить цитоплазму: срез помещают на 1—1,30мин в 1% водный раствор светлого зеленого или 0,5% спиртовой раствор прочного зеленого).
8. Обезводить, просветлить и заключить в бальзам.
Участки ядер, содержащие ДНК, окрашиваются в красновато-пурпурный цвет(цитоплазма светло-зеленая).
Источник
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли широкое применение в основном при диагностике инфекций. В настоящее времяиспользуются тест-системы для распознаваниятаких видов и групп бактерий, как хламидии, микобактерии, энтерококки, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В.
Метод сравнения геномов по составу основания ДНК. Как известно,ДНК содержит четыре азотистых основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц). По правилам спаривания оснований А = Т и Г = Ц, но молярное отношение (Г + Ц): (А + Т) варьирует у разных видов и может служить таксономической характеристикой.
Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, то о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т. е. по температуре, при которой происходит разрыв водородных связей, соединяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плотности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (максимум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК поглощение возрастает и, когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.
У каждого бактериального вида ДНК содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравниваемых микроорганизмов существенно отличается(10. 15 %), то говорят об их принадлежности к различным таксономическим группам. Однако отсутствия существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заключения о тождестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие генетические методы.
Гибридизация нуклеиновых кислот. В основу метода положена способность нуклеиновых кислот соеденяться с комплементарными фрагментами искусственных нитей ДНК/РНК, что названо гибридизацией. Искусственные нити метят изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Затем образец исследуют в ИФА.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот на твёрдой основе и его сэндвич-модификация распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Несвязавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.
Метод генных зондовиспользуют для идентификации бактерий. От обычной ДНК–ДНК гибридизации этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а определенного ее фрагмента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК разделяют электрофоретически, методом трансформации определяют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным известным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, затем эту меченую ДНК гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауторадиографии выявляют относительную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бактерии – донора ДНК) и исследуемой бактерии..
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Сущностью реакции является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК invitro. Амплифицируемый участок именуют амплификоном.
Для работы ДНК – полимеразы необходимым условием является наличие матрицы и затравки (праймеров). Матрицей является одноцепочечная ДНК, которую ДНК – полимеразы копируют, синтезирую комплементарную полидезоксирибонуклеотидную цепь. Синтез не может начаться без затравки (праймера), представляющей собой олиго- или полинуклеотид комплементарный матрице и ммеющий свободнаю 3 -1 -ОНгруппу, с которой начинаетя присоединение первого нуклеотида вновь синтезируемой цепи. После присоединения каждого нового звена удлиненная цепь содержит на 3 -1 — конце свободную гидроксильную группу, к которой может присоединяться новое звено нуклеотидов. Процесс продолжается пока ДНК не станет полностью двухцепочечной. Таким образом, фермент выполняет функцию отбора нуклеозидтрифосфатов, комплементарных каждому следующему звену матрицы.
Праймеры – это отрезки одноцепочечной ДНК длиною 20-30 нуклеотидов, комплементарные каждой из цепей матрицы и служащие затравкой для синтеза новой цепи ДНК. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК и ориентированы 3 -1 -концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать.
При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК и каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера.
Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК амплификонов в количестве достаточном для дальнейшего исследования или индикации.
Индикация может быть произведена известными способами:
Электрофорезом в агарозе с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно меченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометрическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот.
Основные компоненты ПЦР:
1. термостабильный фермент ДНК-полимера;
2. пара олигонуклеотидных праймеров;
3. четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов;
4. копируемая ДНК;
5. ионы Mg +2 необходимые для функционирования ДНК – полимеразы;
6. буферный раствор для поддержания рН во время ПЦР между 6,8-7,8 и минеральное масло для предотвращения испарения.
7. Аплификатор – прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающий поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.
Технология идентификации ДНК – содержащих микроорганизмов заключается в следующем:
1. Из исследуемого материала выделяется ДНК – матрица;
2. В пробирке смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНК – полимеразу;
3. Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК (94°С), при этом две цепи ДНК расходятся;
4. Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров с ДНК – матрицей (40-60°С) в последующем;
5. ДНК- полимераза осуществляет комплементарное достраивание нитей ДНК с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (72°С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала;
6. В последующем цикле синтез осуществляется с 4 копий, далее с 8 и т.д. до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса или бактерий;
7. Индикация амплифицированного генетического материала проводится выше изложенным способом.
В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК выбранному для амплификации.
Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФИ для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов.
Индикация РНК – содержащих вирусов включает этапы:
1. Выделение РНК из вируссодержащего материала;
2. Синтез на молекуле РНК вируса комплементарной ей цепи ДНК с помощью специфических праймеров и ревертазы (РНК зависимой ДНК – полимеразы);
3. Амплификация комплиментарной ДНК методом ПЦР;
4.Многократное повторение циклов денатурации к ДНК в исследуемой пробе при температуре 94°С;
5. Сплавление (ожиг) с исследуемой ДНК специфичных нуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 56 °С и синтез с них комплементарных цепей ДНК с помощью фермента термостабильной ДНК – полимеразы при температуре 72 °С. Это приводит к тому, что после 30-40 циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет легко учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием на приборе «Трансиллюминатор».
Анализ с помощью микроматриц. Простейшая микроматрица представляет из себя твердый носитель (нейлоновая мембрана, стеклянный слайд или кремниевая пластинка), на которую нанесены небольшие количества одноцепочечной ДНК (оцДНК) различных известных видов бактерий. Когда на микроматрицу наносится оцДНК, тогда в случае, если на матрице имеется комплементарные ей цепи, происходит гибридизация. Анализ при помощи метода ДНК-микроматрицы для микроорганизмов проходит через этапы подготовки зондов, гибридизации и анализа результатов.
На настоящий момент на одной микроматрице помещается от нескольких сотен до нескольких тысяч проб оцДНК различных видов микроорганизмов. При исследовании патовариантов Xanthomonas использовали микроматрицу с 47 пробами для фингерпринтинга 14 близкородственных штаммов. Этим методом были выявлены однозначные различия между штаммами.
Для определения количественного и видового состава бактериального сообщества без культуральной изоляции можно использовать пробы из последовательности 16S-PHK. Очевидно, что метод микроматриц представляет собой отличный инструмент для определения видов бактерий и биотипирования. Микроматрицы производятся большим числом коммерческих предприятий. Среди производимых микроматриц существуют ДНК-, РНК- и белковые микроматрицы; последние находят широкое применение.
Дата добавления: 2019-09-13 ; просмотров: 297 ; Мы поможем в написании вашей работы!
