Способы консервации пат материала для вирусологических исследований

Методы обнаружения вирусов. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций. Забор материала для выявления вирусов. Культуры клеток для выявления вирусов.

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала для выявления вирусов

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток для выявления вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3

4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Источник

1.4 Основные методы консервации вирусов

Применяют следующие методы консервация вирусов:

1) при хранении плотного вирусного материала (кусочки органов или тканей) часто используют глицерин (50%-ный раствор на физиологическом растворе), который обладает бактериостатическим действием и в то же время защищает вирусы. В этом случае вирус можно хранить при 4°С несколько месяцев;

2) чаще всего вирусы хранят в холодильниках, обеспечивающих температуру минус 20, минус 30, минус 70 °С. При этой температуре некоторые вирусы без добавки защитных веществ сравнительно быстро теряют инфекционность. Известно, что чем меньше белка в вируссодержащей взвеси, тем меньше стабильность вирусов, поэтому очищенные вирусы быстро теряют свою биологическую активность. Хорошее защитное действие при замораживании и хранении вирусов оказывает добавка одного из следующих компонентов: инактивированной сыворотки крови, обезжиренного молока (от 10 до 30 %), желатина (0,5–1,5 %), ДМСО (10 %) и др. При быстром замораживании вируса до минус 196 °С (жидкий азот) с последующим хранением при этой температуре титр вируса в течение нескольких месяцев не снижается. Вирусы, чувствительные к низким значениям рН, следует замораживать в жидкостях, не содержащих однозамещенных фосфатов (NaH₂PO₄ или КН₂РО₄), которые обладают кислой реакцией и имеют более низкую точку замерзания, чем двузамещенные фосфаты (Na₉HPO₄ или К₂НРО₄) с щелочной реакцией.

Скорость оттаивания вируса существенно не влияет на его активность. Размораживать вирусы можно как при комнатной температуре, так и в водяной бане при температуре 37 °С. Во избежание частого замораживания и оттаивания одного и того же вируссодержащего материала необходимо хранить его маленькими порциями, достаточными для одноразового титрования или использования, например для реакции нейтрализации;

3) лиофилизация, т. е. высушивание в замороженном состоянии в условиях вакуума, – очень хороший способ консервирования вирусов. Для лиофилизации необходимы соответствующая аппаратура, определенный (в зависимости от вида вируса) наполнитель и тщательное выполнение процедуры сушки. На стойкость лиофилизированного вируса влияет не только выбор соответствующего наполнителя, но и состав газа в ампуле (уже 0,5 % кислорода вызывают быструю гибель вируса, в то время как влажность в границах 2–3 % существенно не влияет) и температура хранения лиофилизата – не выше 4 °С. Лиофилизацию лучше проводить в учреждениях, хорошо знакомых с этой методикой. В лиофилизированном виде вирусы могут храниться несколько лет.

Вирусологическая лаборатория должна иметь следующую документацию:

– журнал вирусологических исследований (экспертиз, сельхозучета, формы № 13-вет);

– журнал учета зараженных животных;

– журнал учета выделенных вирусов и их уничтожения;

– журнал учета движения производственных или музейных штаммов и другие книги учета согласно утвержденной инструкции.

1. Ознакомиться с вирусологической лабораторией и ее основным оборудованием.

2. Изучить правила работы с вируссодержащим материалом.

Самостоятельная работа студентов:

а) подготовка бокса для работы;

б) отработка навыков работы с пипеткой и стерильными инструментами;

в) изучение документации лаборатории.

Подведение итогов занятия.

Задание к следующему занятию.

1. Какова роль вирусов в инфекционной патологии животных?

2. Что вы знаете о технике безопасности и правилах работы в вирусологической лаборатории?

3. Какие методы консервации вирусов вы знаете?

4. Какие способы уничтожения вирусов существуют в лабораторной практике?

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Источник

Отбор и транспортировка проб биологического материала для исследований методом ПЦР на респираторные вирусы, включая высокопатогенные штаммы вируса гриппа А (H1N1) pdm09

Сбор клинического материала, упаковку и доставку проб осуществляет медицинский работник ЛПО, согласно МР 01/7161-9-34 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа А (H1N1), у людей». Обязательно наличие сопроводительной информации по форме направления на микробиологические исследования. В направлении на исследование необходимо дополнительно указывать лиц, страдающих сахарным диабетом, ожирением, ВИЧ инфекцией, сердечно-сосудистой и легочной патологией, беременных.

Для забора и доставки материала лечебно-профилактические организации края должны быть обеспечены одноразовыми пластиковыми пробирками и флаконами с завинчивающимися крышками, зондами-тампонами в индивидуальной упаковке или пробирке (тубсере). Не допускается забирать материал в агаризованные транспортные системы среды (Эймса, Кери-Блейр, Стюарта).

Правила сбора клинического (секционного) материала

Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактической организации, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность высокопатогенными штаммами вируса гриппа A(H1N1). Забор производят в стерильные одноразовые пластиковые пробирки, контейнеры, стерильными инструментами. Все виды работ проводят с соблюдением противоэпидемического режима, в строгом соответствии с требованиями действующих нормативно-методических документов.

Упаковка, маркирование, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики заболеваний, должны соответствовать требованиям действующих нормативно методических документов.

Для исследования забирают следующие виды клинического материала:

— мазки из полости носа (обязательный материал для ОТ-ПЦР-анализа);

— мазки из ротоглотки (обязательный материал для ОТ-ПЦР-анализа);

— носоглоточное отделяемое (для выделения вируса, ОТ-ПЦР-анализа);

— мокрота (при подозрении на вирусную или вирусно-бактериальную пневмонию).

Целесообразно также включать в исследование аспираты из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и биоптаты легких при возможности их забора. Данные процедуры осуществляет подготовленный медицинский персонал в соответствии с действующими нормативно-методическими документами (МР от 24.05.09 № 01/7161-9-34, МУК 4.2.3115-13).

Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ «Лепесток-200»), защитных очках или щитках для защиты лица, бахилах, двойными резиновыми перчатками. После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

Выбор времени забора клинического материала очень важен, так как наиболее высокое содержание вируса в дыхательных органах человека регистрируется в течение первых четырех дней после появления признаков заболевания. Образцы должны быть собраны в течение 3 суток после появления клинических признаков.

Для постмортальной диагностики используют аутоптаты легких, трахеи и селезенки.

От одного больного должно забираться не менее двух видов клинического материала. Обязательно следует забирать мазки из полости носа, мазки из ротоглотки. Каждый образец материала помещают в отдельную транспортную емкость.

Упаковка и транспортирование образцов.

Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть герметично упакованы в соответствии с действующими нормативно-методическими документами:

1) в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, проверенные на герметичность); плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой герметизируют различными пластификаторами (парафин, лейкопластырь и др., но не скотч), емкость маркируют;

2) в плотный полиэтиленовый пакет подходящего размера с ватой (или другим гигроскопичным материалом) в количестве достаточном для адсорбции всего образца в случае его утечки; полиэтиленовый пакет следует герметично заклеить или запаять.

В отдельный полиэтиленовый пакет вкладывают бланк заполненного направления. Пакеты с образцами от одного пациента вместе с направлением упаковывают во второй плотный полиэтиленовый пакет. Не допускается упаковывание образцов материалов от разных людей в один и тот же пакет.

Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоизолирующий, плотно закрывающийся контейнер (термос, сумка-холодильник), приспособленный для транспортирования биологических материалов в вертикальном положении, исключающем переворачивание образцов.

В термоконтейнеры и термосы помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. К наружной стенке термоконтейнера или термоса прикрепляют этикетку с указанием вида материала, условий транспортирования, названия пункта назначения. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указаны в приложении № 1. На транспортировочные термоконтейнеры должно быть нанесено название лечебной организации краской, устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств.

Транспортирование проб клинического материала в лаборатории для первичного исследования материала осуществляется нарочно лицом, информированным о правилах доставки материала в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. Термоконтейнеры, термосы после доставки материала двукратно обрабатываются дезинфицирующим раствором и возвращаются на следующий день лечебно-профилактической организации.

Файлы для загрузки: