Биохимические свойства бактерий. Методы изучения
Блок
Бактериологический метод диагностики. Достоинства и недостатки.
Бактериологический метод – метод идентификации микроорганизмов по их биологических свойствам.
Метод выделения чистых культур позволяет выделить из естественной среды обитания ― тканей и жидкостей организма человека или внешней среды ― отдельные виды микробов. Это достигается посевом материалов в искусственные питательные среды
Чистые культуры патогенных микробов, выделенные от больных людей и животных, позволяют своевременно установить диагноз и определить природу инфекционного заболевания. Они являются исходным материалом для получения бактерийных препаратов (вакцины, токсины, фаги, антибиотики и т. д.) Выделенная чистая культура идентифицируется по морфологическим, тинкториальиым, культуральным, токсигенным и биохимическим свойствам, по антигенной структуре и вирулентности. Идентификация представляет собой комплекс микроскопических, бактериологических, иммунологических и биологических исследований, применяемых для определения типа и вида бактерий.
· высокая информативность, объективность
· высокая чувствительность, специфичность
· возможно определить чувствительность к антибиотикам
· возможно внутривидовое типирование (разделение микроорганизмов на мелкие группы для установления источников заражения)
· не все м.о. растут на питательных средах
· результат зависит от квалифицированности и опыта работника
Условия для культивирования:
Результат: рост колоний. Колония-потомство одной микробной клетки на плотной среде
Для уплотнения среды используют агар-агар, его преимущества:
· Его не переваривают м.о.
· Т плавления=100 градусов
· Т застывания=45 градусов
Полужидкие среды используют для длительного хранения культур, изучения подвижности.
Бактериологический метод диагностики. Основные этапы.
Этап
· Подготовительные мероприятия. Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.
· Обогащение. Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37о.
· Микроскопия. Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом — исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.
· Создание отдельных колоний. На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37о. Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одной стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.
Этап
· Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия. Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.
· Накопление чистой культуры. Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37о, но в некоторых случаях может быть иной). Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет.
Этап
· Уровень роста и чистоты культуры. В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.
Биохимические свойства бактерий. Методы изучения
Биохимические свойства — способность микроорганизмов к ферментации и ассимиляции тех или иных химических веществ. У бактерий различают три основные группы ферментов:
· Конститутивные — постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.
· Индуцибельные — синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.
· Репрессибельные — синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом. Для идентификации микроорганизмов — возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков.
Биохимические признаки
· гликолитические свойства бактерий (бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. Определение сахаролитических ферментов проводится на средах пестрого ряда, средах Гисса. Пестрые ряды, среды Гисса-состав: питательная основа-пептонная вода, любой сахар, индикатор рН
В пробирку с глюкозой помещают «поплавок» для определения продукции газа (изначально все желтое, а потом окрашивается в розовый) Для определения протеолитических ферментов — коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) СИБ — набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Диски фильтровальной бумаги пропитывают индикаторными (дифференциальными) средами. В высушенном состоянии диски можно длительно хранить. Перед использованием диски раскладывают пинцетом в стерильные пробирки и добавляют суспензию идентифицируемой культуры в физрастворе)
· протеолитические свойства бактерий (расщепление желатина, если разжижает-есть активность м.о. Или мясо-пептонный бульон, любая простая среда)
Для определения протеолитических ферментов — коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо-пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ) СИБ — набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Диски фильтровальной бумаги пропитывают индикаторными (дифференциальными) средами. В высушенном состоянии диски можно длительно хранить. Перед использованием диски раскладывают пинцетом в стерильные пробирки и добавляют суспензию идентифицируемой культуры в физрастворе
·липолитические свойства (желточно-солевой агар, расщепление лецитина)
Дата добавления: 2018-10-27 ; просмотров: 3983 ; Мы поможем в написании вашей работы!
Источник
Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов.
Выявление сахаролитической активности микроорганизмов. В состав дифференциально-диагностических углеводных сред (среды Гисса — см. тему 7) входят различные соединения, которые можно условно назвать сахарами: моносахариды, полисахариды, многоатомные спирты. При утилизации углеводов в качестве конечных продуктов образуются кислоты и газообразные продукты. Соответственно расщепление углевода регистрируют по изменению рН среды и выделению газообразных продуктов. Закисление питательной среды улавливают при помощи различных индикаторов.
Индикатор BP, входящий в состав сухих сред Гисса, меняет цвет от розового в щелочной среде через серый при нейтральном рН до голубого или ярко-синего в кислой среде.
В жидких средах Гисса образование газов при утилизации субстрата улавливают при помощи поплавков («газовок») — стеклянных трубочек, запаянных в верхнем конце и помещенных в пробирки. В «газовках» скапливаются газы, вытесняющие жидкую питательную среду; в полужидких средах Гисса газообразные продукты остаются в толще среды в виде пузырьков.
Выявление протеолитических и других ферментов микроорганизмов.Протеолитические ферменты расщепляют белки питательной среды до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов
Тест на желатиназу: культуру микроорганизма засевают уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12 % желатины. После культивирования опытную и контрольную (незасеянную) пробирки охлаждают под холодной водой и по «текучести» желатины делают заключение о наличии фермента.
Тест на сероводород: узкие полоски фильтровальной бумаги смачивают в 5%-м растворе ацетата свинца, высушивают, стерилизуют. Культуру микроорганизма засевают в питательную среду в пробирке, после чего индикаторную бумагу помещают в пробирку (не должна касаться среды) и закрепляют пробкой. Выделяющийся сероводород реагирует с ацетатом свинца, и образующийся сульфид свинца вызывает почернение бумаги (положительный результат). Описанный метод выявления сероводорода при помощи индикаторных бумажек считают одним из наиболее чувствительных, разработаны и другие методы
Тест на аммиак: исследуемую культуру засевают в жидкую питательную среду в пробирке. Между пробкой и стенкой пробирки закрепляют полоску розовой лакмусовой индикаторной бумажки. Посевы инкубируют в термостате 1. 5сут. Посинение лакмусовой бумажки свидетельствует о выделении аммиака.
Тест на уреазу: исследуемую культуру микроорганизма засевают на среду Кристенсена (пептон — 1 г, хлорид на трия — 5 г, дигидрофосфат калия — 2 г, агар — 20 г, глюкоза — 1 г, 0,2%-й раствор фенолрота — 6 мл, 20%-й раствор мочевины — 100 мл, вода дистиллированная — 1000 мл) и выращивают 1. 4сут. Положительный результат — покраснение среды в результате ее защелачивания.
Тест на каталазу: бактериальную массу снимают с поверхности агара бактериологической петлей и суспендируют в капле 3%-го раствора перекиси водорода на предметном стекле. Положительный результат — образование пузырьков газа.
Основные принципы идентификации бактерий.
Основная задача бактериологического диагностического исследования — это определение таксономического положения выделенного микроорганизма путем сравнения его свойств со свойствами известных видов.
В рутинной бактериологической практике микроорганизм идентифицируют, изучая его фенотипические признаки (морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, патогенные). Стали получать распространение некоторые методы идентификации по генотипическим признакам (см. тему 12), которые ранее в основном применяли в научной работе для классификации микроорганизмов с неясным таксономическим положением.
В бактериологии для идентификации используют определители микроорганизмов. Наиболее популярный — определитель бактерий Берджи — включает в себя описание свойств известных видов микроорганизмов. Бактерии в этом руководстве по ограниченному числу морфологических и физиологических признаков объединены в большие группы, например группа № 20 «Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы» или группа № 5 «Факультативно-анаэробные грам-отрицательные палочки». В пределах этих групп при помощи нескольких дифференцирующих признаков бактерии подразделены на семейства, роды и виды. Распределение микроорганизмов в этом определителе не отражает иерархической классификации, а преследует сугубо практическую цель — как можно быстрее и экономичнее установить таксономическое положение изучаемого микроорганизма.
Идентификация неизвестного микроорганизма представляет собой процесс последовательного его отождествления с той или иной большой группой микробов, характеризующихся общими свойствами, затем с семейством в пределах группы, далее с тем или иным родом в пределах установленного семейства, и на конечном этапе исследуемый микроорганизм отождествляют (идентифицируют) по совокупности морфологических, тинкто либо видом в пределах рода. В случае необходимости внутри вида устанавливают принадлежность культуры к био-, серо-, фаговару. Работа с определителем Берджи предполагает использование достаточно большого количества тестов, характеризующих различные свойства микроорганизма. В практических диагностических лабораториях, исходя из эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, обычно проводят бактериологические исследования, заранее ориентированные на обнаружение возбудителя определенной инфекционной болезни, по схеме, предусмотренной официальной инструкцией.
Морфология прокариот. Форма и размер бактериальной клетки.
Выделяют следующие формы бактерий: шаровидные, палочковидные, извитые,.
Шаровидные бактерии
Шаровидные бактерии объединены общим названием «кокки» (в переводе с греч. «зерно»). Они могут быть круглой формы, продолговатые (овальные) или немного сплющенные. Их средний размер – от 0,5 до 1 мкм в диаметре. Они неподвижны и не образуют спор. Среда их обитания – почва, воздух, продукты.
· Монококки размножаются в пределах одной плоскости и в дальнейшем располагаются по одиночке, хаотично. Не патогенны.
· Диплококки располагаются преимущественно парами, не выходя за пределы одной плоскости (возбудители гонореи).
· Стрептококки в процессе размножения связываются между собой в одной плоскости, образуя строение, подобное бусам (вызывают сепсис, ангину, пародонтит, менингит, участвуют в приготовлении сметаны и масла).
· Тетракокки делятся в двух противоположных направлениях (перпендикулярно). В результате с каждой стороны образуется квадрат из 4 клеток. Не патогенны.
· Сарцины делятся в трех направлениях перпендикулярно друг другу, собираются по 8 клеток, образуя куб. Не патогенны.
· Стафилококки размножаются в спонтанных направлениях, в результате образуются скопления бактерий, по структуре напоминающие кисть винограда (у человека стафилококк поражает многие органы: кожу, легкие, кости, сердце)
Палочковидные бактерии
Палочковидные бактерии отличаются цилиндрической или яйцевидной формой.
По размеру палочковидные микроорганизмы могут быть короткими или очень короткими, тонкими или очень тонкими, по структуре – прямыми или ветвящимися. Длина таких палочек варьируется от 1 до 6 мкм, а толщина – от 0,5 до 2 мкм. Концы их клеток имеют разную форму. Число палочковидных микроорганизмов значительно превышает количество кокков, в большинстве своем они болезнетворны.
Отличительной чертой отдельных представителей палочковидных является их способность к спорообразованию (бациллы, клостридии). Эта функция защищает микроорганизмы от опасных температур, ядовитых веществ и радиации – своеобразная реакция на неблагоприятную среду. Споры могут оставаться жизнеспособными на протяжении 30 – 40 лет. Кроме спорообразования, палочковидные формы обладают еще одним весомым плюсом по сравнению с кокками – подвижностью.
Извитые бактерии
Извитые бактерии имеют более или менее выраженную форму спирали. Размер этих бактерий варьируется от 0,1 до 500 мкм. Размножение происходит путем деления клетки.
иды извитых одноклеточных
· Вибрионы имеют незначительный изгиб (не более четверти оборота спирали) и самые малые размеры в этой группе микроорганизмов – до 3 мкм (возбудитель холеры).
· Спириллы насчитывают от 1 до 6 оборотов спирали. Эти бактерии покрыты эластичной оболочкой, что обеспечивает их подвижность в процессе сжатия и распрямления по спирали (возбудитель содоку – инфекция укуса крыс).
· Спирохеты по своему строению отличаются значительным превышением длины тела относительно его ширины, имеют много оборотов спирали (винтообразные). Размер этих клеток достигает 500 мкм. Они обладают подвижностью благодаря наличию жгутиков (бактерия кариеса).
Источник
