Способы генной инженерии растений

Генная инженерия растений. Методы, устойчивость растений

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

5.1 Проблемы биобезопасности

5.2. Получение трансгенных растений

5.3. Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений

5.4. Повышение эффективности процесса фотосинтеза

5.5. Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

5.6. Изменение качества плодов

5.7. Устойчивость растений к гербицидам

5.8. Устойчивость растений к фитопатогенам и насекомым

5.9. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби­нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целена­правленного изменения генотипа — трансформации — благода­ря введению определенных генов.

Считается, что трансгенные растения более безопасны, чем сорта, полученные методами традиционной селекции, но с при­менением мутагенеза (В. Ф. Федоренко и др., 2005). Есть мнение, что риск использования трансгенных растений в мирных биотех­нологиях намного ниже, чем в случае применения других транс­генных организмов (Я. И. Бурьянов, 1999). Генетическая инжене­рия растений развивается очень быстрыми темпами. Она позво­ляет решать проблемы фундаментальной науки, а также много­численные практические задачи. Намечается тенденция разделе­ния прикладных генно-инженерных исследований на три направ­ления:

1. Решение проблем сельскохозяйственного комплекса, таких, как повышение продуктивности сельскохозяйственных растений, их защита от различных биотических и абиотических факторов. Это особенно важно в связи с быстрым ростом населения Земли. Считается, что генетически модифицированные (ГМ) растения помогут решить проблему увеличения производства продуктов питания, поэтому сейчас наблюдается весьма значительное рас­ширение сельскохозяйственных угодий, занятых посевами ГМ – растений. Если в 1996 г. эти посевы занимали 1,7 млн га, то в 2001 г. — 52,6 млн га, а в 2003 г. — почти 70 млн га.
2. Создание трансгенных растений — продуцентов новых ве­ществ для использования в области медицины и технической про­мышленности, приспособленных для роста в полевых условиях. Так, на основе трансгенных растений возможно получение «съе­добных» вакцин, антител (например, иммуноглобулиновых ком­плексов).

Развитие и совершенствование культуры трансгенных клеток и тканей растений, синтезирующих ценные биологически активные соединения. Довольно часто продуцентами важных пищевых, лекарственных или технически важных веществ служат уникальные тропические и эндемические растения, не доступные для выращи­вания в других климатических зонах или занесенные в «Красную книгу». Перенос генов, отвечающих за синтез специфических со­единений, из редких растений в более доступные превращает пос­ледние в биологические фабрики необходимых веществ.

Генетическая трансформация может принести большую пользу для сельского хозяйства, медицины, промышленности, фундамен­тальной науки.

Однако биотехнология и, в частности, генетическая инжене­рия подошли к той ступени развития, когда приходится прежде всего думать о возможных последствиях эксперимента, об исполь­зовании полученных знаний. «Генетическая инженерия — это мощный способ изменить жизнь, но ее потенциал может пред­ставлять собой опасность» (Р. Доукинс, цит.: Современная биотех­нология. Мифы и реальность, 2004). В связи с этим первостепен­ными становятся вопросы биологической безопасности.

Под биологической безопасностью понимается защищен­ность человека, общества, цивилизации и окружающей среды от вредного воздействия, опасного для жизни и здоровья лю­дей, от токсичных и аллергенных биологических веществ и со­единений, содержащихся в природных или генетически моди­фицированных биологических объектах и полученных из них продуктах (О. С. Машкина, А. К. Буторина, 2005). В настоящее время выделяют три группы риска, возникающие при возделы­вании и потреблении генетически модифицированных организ­мов (ГМО): пищевые, экологические, агротехнические. Причи­ны возникновения этих рисков состоят в непредсказуемости встраивания дополнительной ДНК в геном организма, возмож­ности плейотропного эффекта встроенного гена, нарушении стабильности генома трансгенных растений, присутствии во встраиваемой конструкции «лишних» векторных генов, аллерги­ческих и токсических эффектах чужеродного белка, возможно­сти горизонтального переноса трансгенных конструкций в геном симбионтных для человека и животных бактерий (В. В. Кузнецов и др., 2004). По-видимому, есть закономерность между увеличе­нием числа аллергических заболеваний и потреблением ГМ-про- дуктов в странах, где это потребление разрешено. Так, в США и Скандинавии был проведен сравнительный анализ количества пищевых заболеваний. Эти страны были выбраны в связи с тем, что единственным существенным различием в качестве питания были потребление генетически модифицированных продуктов в США и их отсутствие в рационе народов Скандинавии. Оказа­лось, что в США частота пищевых заболеваний в 3 — 5 раз выше

чем в странах Скандинавии (В. В. Кузнецов и др., 2004). Нельзя исключить, что генетическая инженерия может привести к ре­зультатам, опасным для человека и природы. Поэтому несомнен­но, что биологическая безопасность должна стать одной из при­оритетных задач человечества в целом и каждой цивилизован­ной страны в отдельности (А.С.Спирин, 1997, цит.: В.В.Кузне­цов и др., 2004).

5.2. Получение трансгенных растений

Технологии получения трансгенных растений практически совпадают с теми технологиями, которые обсуждались в учебном пособии, когда речь шла о передаче генетической информации у микроорганизмов и животных. Поэтому в данном разделе рас­смотрим только те системы, которые специфичны для раститель­ных организмов.

Векторы на основе Ti-плазмид. Перенос генов и их встраи­вание в геном двудольных растений (трансформация) осуществ­ляются главным образом благодаря конструированию векторов, характерных для растений. Эти векторы создаются на основе Ti-плазмид, находящихся в клетках бактерий Agrobacterium faciens.

Среди многочисленных почвенных бактерий существуют бак­терии рода Agrobacteria, которые могут передавать часть своих генов в геном растительной клетки, вызывая коренные измене­ния в ее свойствах. Так, бактерия A. tumefaciens вызывает обра­зование опухолей — корончатых галлов. Способность этой бак­терии к образованию опухоли связана с геномом большой внехромосомной плазмиды —Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing — ин­дуцирующие опухоль). Другие бактерии ( . rhizogenes) вызывают усиленное образование корней при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в бактериальных клетках Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ti- и Ri-плазмиды — естественные векторы для дополнительных генов, обладающие свойствами, которые необходимы для трансформа­ции растительных клеток. Они имеют широкий круг хозяев, а в бактериальных клетках реплицируются автономно. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они не онкогенны. Клетки растений, трансформированные с помощью Ri-плазмид, сохраняют способность к морфогенезу и регенерации растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные для создания векторов. Однако Ti-плаз­миды изучены лучше, поэтому их, как правило, используют при работе с растениями.

Доказательством того, что именно Ti-плазмиды отвечают за трансформацию растительных клеток в опухолевые, служит тот факт, что клетки агробактерий, лишенные Ti-плазмид, не могут вызвать в инфицированном растении ни образования коронча­тых галлов, ни синтеза опинов. Опины — это уникальные продук­ты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров, которые используются бактериями в качестве источников азота, углерода и энергии.

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраи­вает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставля­ет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, необходимые для бактерий. Сама бактерия в растительную клет­ку не проникает. Она остается в межклеточном пространстве, используя трансформированные клетки растений в качестве био­логической «фабрики» по производству опинов.

Участок Ti-плазмиды, который встраивается в геном расти­тельных клеток, называется Т-ДНК — трансформирующая ДНК (transferred DNA). Величина Т-ДНК составляет примерно 10% от размера всей Ti-плазмиды, т.е. 12—22 тыс. п.н. Т-ДНК содержит гены, отвечающие за индукцию образования опухоли, синтез опи­нов и фитогормонов (ауксинов и цитокининов), подавляющих дифференцировку клеток растения-хозяина. Гены, отвечающие за вырезание Т-ДНК и ее перенос в растительную клетку, располо­жены в области вирулентности (vir-область) той же самой плаз­миды. Кроме того, в состав Ti-плазмиды входят гены tra-области, контролирующие конъюгацию бактерий, и гены ori-области, продукты которых обеспечивают репликацию Ti-плазмиды (рис. 5.17).

Молекулярно-генетический механизм естественной трансфор­мации растительных клеток с помощью Ti-плазмид изучен дос­таточно хорошо. В этом процессе можно выделить несколько этапов:

• восприятие раневых си гнал ор растительной клетки хеморе­цепторами бактерии и прикрепление агробактерии к стенке клет­ки растения;
• вырезание Т-ДНК из Ti-плазмиды;
• проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения;
• интеграция Т-ДНК в геном растения и ее экспрессия.

Трансформация начинается только там, где есть поврежденные клетки. Весь процесс «узнавания» нужной растительной клетки, вырезания, транспорта и встраивания Т-ДНК в растительный геном осуществляют белки — продукты генов, локализованных в vir-области Ti-плазмиды. Продукты гидролиза поврежденной кле­точной стенки (ацетосирингон и гидроксиацетосирингон) воспринимают хеморецепторы, встроенные в плазматическую мем­брану агробактерии.

Среди них одна из главных ролей принадле­жит продукту деятельности генов vir-области — гистидиновой протеинкиназе, которая активирует транскрипцию остальных vir- генов. Индукция этих генов обратима, что очень важно для бак­терий. Если растительный организм ослаблен или вообще нежиз­неспособен, процесс останавливается и Т-ДНК не переносится в такую клетку. Другой продукт генов vir-области — эндонуклеаза, которая отвечает за вырезание Т-ДНК. Белки virB и virE транс­портируют Т-ДНК в одноцепочечной форме из бактерии в цито­плазму растительной клетки. Механизм переноса Т-ДНК, по-ви­димому, аналогичен переносу плазмидной ДНК в процессе конъ­югации. Встраивание Т-ДНК в геном клетки растения становит­ся возможным благодаря наличию гомологичных участков между растительной и плазмидной ДНК в местах встраивания. После внедрения Т-ДНК становится обычной частью генома растения и наследуется как доминантный признак в соответствии с зако­нами Менделя (рис. 5.18).

Именно способность участка Ti-плазмиды A. tumefaciens встраиваться и экспрессироваться в геноме растительной клетки послужила поводом для попытки создания на основе этой плаз­миды вектора, доставляющего дополнительные гены в клетку. Т-ДНК ограничена с двух сторон повторяющимися последова­тельностями (фланкирующими последовательностями), по кото­рым и происходит вырезание этого участка ДНК из плазмиды. Ка­залось бы, что любая ДНК, встроенная между этими последова­тельностями, будет принята за Т-ДНК и перенесена в раститель­ную клетку любых двудольных растений.

Однако,Ti-плазмида как вектор обладает некоторыми недо­статками: большие размеры Ti-плазмиды (от 200 до 800 тыс. п. н.); отсутствие способности реплицироваться в клетках Е. coli, что необходимо для клонирования рекомбинантных плазмид; неспо­собность трансформированных с помощью Ti-плазмид клеток к регенерации целого растения; неспособность к трансформации клеток почти всех однодольных растений. Основной недостаток — слишком большие размеры Ti-плазмиды, которые делают весьма затруднительными манипуляции с ней во время конструирования вектора. Для решения этой проблемы разработана технология создания промежуточного вектора с применением классического объекта генетической инженерии – Е.coli.

Процесс начинается с создания рекоминантной структутры, которую можно достаточно просто клонировать, т.е. многократно увеличивать число ее копий. Т-ДНК вырезают в помощью рестриктаз из Ti-плазмиды и встраивают в небольшую плазмиду pBR322, способную реплицироваться в клетках E.coli. В этих клетках рекомбинантную ДНК клонируют, после чего встраива­ют в Т-ДНК дополнительные гены и повторяют клонирование. Полученные многочисленные копии промежуточной векторной ДНК вводят в клетки A. tumefaciens, содержащие обычные Ti- плазмиды. В результате гомологичной рекомбинации Т-ДНК с встроенными в нее дополнительными генами замещает нормаль­ную Т-ДНК в Ti-плазмидах. После этого отбирают с помощью генов-маркеров трансформированные агробактерии и заражают ими растительные клетки. Дополнительные гены вместе с Т-ДНК встраиваются в геном растения, и в конце концов образуется ге­нетически модифицированный организм с заданными свойства­ми (рис. 5.19). Эту довольно сложную технологию можно упрос­тить, если использовать бинарные векторы.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспе­чивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, со­держащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Вирусы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеиновой кислоты, которые реплицируются и экспрессиру­ются в клетках растений. Подавляющее большинство фитовиру­сов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2% вирусов, инфицирующих растения, отно­сятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для ис­пользования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в ка­честве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ) или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный предста­витель группы вирусов с двухцепочечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения се­мейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большо­го числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10 и более моле­кул на зараженную клетку. Поэтому фитовирусы представляют со­бой очень эффективные средства для получения хорошей эксп­рессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ: малый размер генома (возможность легкой ма­ни пуляции вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечиваю­щие эффективную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенны­ми недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и не­способны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость можно увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК) растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы. Следовательно, часть вирус­ного генома, ответственная за упаковку в вирусные частицы, мо­жет быть удалена и замещена дополнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствие способности встраиваться в ге­ном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальному методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦК встраивают в Т-область Ti- плазмиды и в ее составе интегрируют в ядерный геном различных растений.

Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы стали использоваться для растений благодаря появлению специ­фического объекта — изолированных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

Трансформация растительных протопластов. Метод осуще­ствляется благодаря комбинации методик кальциевой преципи­тации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК).

Заражение культуры протопластов на начальной стадии ее роста агробактериями, которые используют в качестве векторов.

Микроинъекции ДНК. Этот метод аналогичен методу мик­роинъекций животных клеток. Его можно рассматривать как наи­более универсальный. Эффективность трансформации раститель­ных клеток — 10 — 20 % независимо от типа вектора. Трансфор­мация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое ра­стение.

Электропорация. Метод основан на повышении проницае­мости биомембран за счет действия импульсов высокого напря­жения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

Метод биологической баллистики. Это один из самых эффек­тивных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации — суспензионная культура, каллусная ткань или 4 — 5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие ча­стички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бом­бардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клет­ки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

5.3 Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений

Решение проблемы создания новых форм растений подра­зумевает в первую очередь повышение качества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательную и техническую ценность. В основном это касается запасных бел­ков.

В большинстве случаев запасные белки растений имеют несба­лансированный для питания человека и животных аминокислот­ный состав. Так, запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином, что снижает их питательную и кормовую ценность. Улучшение аминокислотного состава бел­ка путем традиционной селекции не дает желательных результа­тов, поскольку необходимые гены часто сцеплены с нежелатель­ными признаками и наследуются вместе. Например, у мутантов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина коррелирова­ло с уменьшением синтеза основных запасных белков — зеина и гордеина, а также с уменьшением урожайности.

Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов:

1) кло­нирование генов запасных белков;

2) изучение механизмов тка­неспецифичной и временной экспрессии белков и выявление пос­ледовательностей ДНК, определяющих данный механизм;

3) це­ленаправленное изменение последовательностей генов запасных белков для улучшения аминокислотного состава;

4) создание век­торов, содержащих измененный ген;

5) введение модифицирован­ных генов в растения.

В настоящее время клонированы 10 генов гордеинов ячменя, гены а- и б-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Имеются практические результаты трансформации растений. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повли­яло на состав и уровень соответствующих запасных белков. В ито­ге улучшилось хлебопекарное качество пшеничной муки.

5.4. Повышение эффективности процесса фотосинтеза

Один из возможных способов увеличения фотосинтеза и, следовательно, продуктивности растений состоит в клонирова­нии хлоропластных генов в клетках бактерий и их переносе в ра­стения. Известно, что хлоропласты и прокариотические клетки сходны по ряду признаков. На основании этого возникла сим­биотическая гипотеза происхождения хлоропластов, впервые выдвинутая А. С. Фаминциным (1886). Согласно этой гипотезе, клетки прокариот и хлоропласты сходны. В них присутствуют кольцевые ДНК, 708-рибосомы; синтез белков начинается с од­ной и той же аминокислоты — N-формилметионина, а синтез белка подавляется хлорамфениколом, а не циклогексимидом, как у эукариот. Позже было показано, что ДНК-зависимая РНК- полимераза Е. coli связывается с определенными участками ДНК хлоропластов шпината.

В клетках Е. coli инициация белкового синтеза частично ре­гулируется доступностью участка связывания рибосом (УСР). Его структура до конца еще не выяснена, но расшифрован участок, известный под названием «последовательность Шайн—Дальгарно» (ШД). Она комплементарна б-концу 168-рибосомальной РНК, и инициация белкового синтеза начинается с образования комплементарной пары между этой последовательностью и 3′-кон­цом 168-рибосомальной РНК. Анализ последовательности ДНК хлоропластного гена большой субъединицы основного фермента фотосинтеза — рибулозобисфосфаткарбоксилазы — оксигеназы (Рубиско) кукурузы — выявил значительные гомологии с извест­ными промоторами и последовательностями ШД клеток Е. coli. Все это привело к попытке клонирования генов хлоропластов в клетках Е. coli, наиболее часто используемой в генно-инженерных исследованиях.

Транскрипционные конструкции могут создаваться двумя пу­тями: во-первых, это установка промотора рядом с УСР, который узнается полимеразой Е. coli, во-вторых, это формирование гибридного УСР, состоящего из прокариотической последовательно­сти ШД и эукариотического или синтетического инициирующе­го кодона. Первый путь широко применяется для увеличения экспрессии генов Е. coli и хлоропластных генов в клетках Е. coli.

В настоящее время уже клонировано несколько хлоропластных генов: гены синтеза субъединиц Рубиско, белка хлорофилл-белкового комплекса, АТФсинтетазы, цитохрома и др.

5.5. Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

Азот — один из самых необходимых элементов для растений. Его недостаток в почве или питательном субстрате часто приводит рас­тение к гибели, поэтому в первую очередь необходимо внесение в почву азотных удобрений. Однако их производство требует очень больших энергетических затрат, поэтому оно дорогостояще. Сто­имость азотных удобрений в 6 раз выше стоимости фосфорных удоб­рений и в 16 раз выше стоимости калийных удобрений. При этом растения используют только от 30 до 70 % внесенных в почву дос­тупных форм азота, остальное просто вымывается из почвы, за­грязняя окружающую среду. Гораздо более естественно и доступно снабжение растений азотом путем его биологической фиксации.

Фиксация атмосферного азота (диазотрофность) — свойство прокариотических организмов. Азотфиксирующие организмы де­лятся на симбиотические (90 %) и свободноживущие (10 %). Фиксация атмосферного азота связана преимущественно с симбиоти­ческими микроорганизмами. В настоящее время известны четы­ре основные системы симбиоза, имеющие большое значение не только для естественных сообществ, но и для сельского хозяйства, лесоводства. Это Rhizobia — бобовые растения, Azolla-Anabaena — рис, Actinomyces — деревья, Spirillum — травы. Атмосфер­ный азот фиксируется благодаря уникальному ферменту — нитрогеназе.

В 1960 г. американские исследователи показали, что нитрогеназа сохраняет свою активность в бесклеточных экстрактах Clostridium pasteurianum. Это послужило толчком для начала ак­тивных исследований биохимии азотфиксации, структуры и ме­ханизма действия нитрогеназы. К 1981 г. нитрогеназа была выде­лена из 36 видов микроорганизмов. Она считается одним из наи­более сложных ферментов, использующих простые субстраты. Кроме азота нитрогеназа может восстанавливать ацетилен, циа­нистый водород, закись азота и некоторые другие соединения. Восстановление ацетилена в этилен позволило разработать надеж­ный тест для обнаружения азотфиксирующей активности. Непре­менное условие работы нитрогеназы — ее защита от кислорода, который ингибирует не только активность нитрогеназы, но и ее биосинтез.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изу­чению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и Е. coli. С помощью техники рекомбинантных ДНК были составлены генетические карты генов азотфиксации (nif-ге­нов), которые показали сходную организацию генов у большей части азотфиксирующих организмов. Было установлено, что nif- гены расположены между генами, кодирующими биосинтез гис­тидина (his) и генами, ответственными за усвоение шикимовой кислоты (shiA). Гены, кодирующие синтез белковых субъединиц компонентов нитрогеназы, образуют единый оперон (рис. 5.20). В клетках симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii плазмиды, кроме структурных генов нитроге­назы, содержат гены, отвечающие за развитие корневых клубеньков у определенных видов бобовых.

Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет пе­редавать способность к фиксации азота организмам, не облада­ющим этим свойством. Среди бактерий, кроме Е. , такой пе­ренос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приво­дить к нежелательным эффектам. Так, перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может уси­лить его патогенное действие. Кроме того, существует вероятность случайного переноса вместе с nif-генами каких-то нежелательных генов.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы вве­дения генов азотфиксации в клетки растений, создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфиксирующими организмами, повышения мощности корневой систе­мы бобовых растений для увеличения на ней количества клубень­ков. Кроме того, предполагается создание новых азотфиксирующих систем путем введения азотфиксирующих микроорганизмов в каллусные ткани растений с последущим образованием из них растений-регенерантов, а также повышение эффективности фиксации азота путем воздействия на гены, контролирующие этот процесс.

Наиболее интересна первая проблема — введение nif-генов в клетки растений. Однако ее решение сопряжено с рядом трудно­стей. Основная — разрушение нитрогеназы под воздействием кис­лорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд при­способлений, защищающих бактерии от свободного кислорода. Среди них присутствие в клетках клубеньков лешглобина — гем- содержащего белка, который встраивается в мембрану бактероида (увеличенной в размере бактериальной клетки, характеризующей­ся наибольшей способностью к фиксации азота) и регулирует по­ступление кислорода. Легоглобин кодируется в геноме раститель­ной клетки-хозяина, но его синтез начинается только после про­никновения бактерий в эту клетку. У цианобактерий механизм за­щиты нитрогеназы от кислорода иной. Азотфиксация идет в гете­роцистах, а фотосинтез — в обычных клетках. Поэтому кислород, выделяющийся в процессе фотосинтеза, не ингибирует фиксацию азота. Введение только nif -генов в какую-то растительную клетку не решает проблемы. Если нитрогеназа будет синтезироваться в этой клетке, в частности в клетках злаков, то она разрушится под действием кислорода, присутствующего в клетке. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии, которое требуется для фиксации азота.

Таким образом, более перспективно повышение эффективно­сти фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а так­же увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов клеточной инженерии.

5.6. Изменение качества плодов

В настоящее время найдены способы регулирования сроков созревания плодов с помощью методов генетической инженерии. Для этого используют метод создания антисмысловой РНК, ко­торый позволяет управлять работой интересующего гена. В рас­тениях ген PG контролирует синтез полигалактуроназы — фер­мента, который участвует в разрушении пектина. Данный фер­мент синтезируется в период созревания плодов томата, они ста­новятся мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение гена PG позволяет получить растения с новыми свойствами — увеличенным сроком хранения и более высокой ус­тойчивостью к грибным заболеваниям. Эту же технологию мож­но применить для регулирования активности другого гена — гена EFE, продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена — фитогормона, одной из функций которого слу­жит ускорение созревания плодов. Отключение данного гена так­же может увеличить срок хранения плодов.

5.7. Устойчивость растений к гербицидам

В сельском хозяйстве широко используют гербициды — хими­ческие соединения, применяемые для уничтожения сорной рас­тительности. Гербициды широкого спектра действия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных рас­тений. В связи с этим возникает необходимость в создании рас­тений, устойчивых к данным веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивых к гер­бицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, ко­торый состоит во введении в растения генов гербицид-резистент­ности растительного или бактериального происхождения.

Изучение механизмов устойчивости служит основой для созда­ния трансгенных растений. Оно включает четыре основных эта­па: выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений; отбор растений, устойчивых к данному гербициду в качестве ис­точника генов резистентности; идентификация и клонирование этих генов; изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях.

Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сель­скохозяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (атразин, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного действия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) были трансформированы с помощью штам­ма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду с встроенным геном bar, кодирующим фермент, придающий устойчивость к гер­бициду биалофосу. Трансгенные растения содержали ген bar и были невосприимчивы к гербициду (А. М. Стефанович, Г. Н. Ралдугина, 1999). Однако в тканях таких растений наблюдается на­копление гербицидов, и использовать эти растения можно толь­ко в технических целях. Вместе с тем было показано, что введе­ние генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить де­токсикацию гербицидов, создавая таким образом растения, при­годные в пищу. Так, детоксикация действующего вещества герби­цида 2,4-D осуществляется при переносе в растение гена монооксигеназы, глифосата — при введении гена фосфонатазы, бромоксилина — гена нитрилазы.

5.8. Устойчивость растений к фитопатогенам и насекомым

Необходимость создания растений, устойчивых к фитопатоге­нам, связана с тем, что насекомые-вредители, вирусные и другие заболевания служат причиной значительного снижения урожай­ности сельскохозяйственных культур.

Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены, насекомые-вредители. В растении существу­ют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степе­ни (в зависимости от устойчивости растений) начинают действо­вать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и бета-1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых ви­дов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут со­здаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок. Той же цели — защите клеток — служит присутствие в кле­точных стенках белков-экстенсинов и олигосахаридов.

Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансген­ные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиноч­ными генами. Благодаря этому были получены трансгенные рас­тения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хи­тиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был вве­ден ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам. Наконец, перспектив­ны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические белки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах мно­гих растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчи­вых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у ра­стений табака, трансформированных геном оболочки вируса та­бачной мозаики (ВТМ).

Еще одна группа методов получения трансгенных растений, ус­тойчивых к действию фитовирусов, включает введение и экспрессию генов антивирусных антител, вирусных сателлитных РНК. Интересный эффект дало введение в геном растений гена чело­веческого интерферона JFN — одного из ключевых белков индук­ции иммунитета у млекопитающих. С помощью вируса мозаики цветной капусты геном интерферона были трансформированы растения турнепса, табака, картофеля, что повысило устойчивость этих растений к вирусным заболеваниям.

Вполне традиционным для придания устойчивости к насеко- мым-вредителям стало внесение в растения гена Bt бактерий Bacillus thurengiensis. Этот ген отвечает за синтез белка протокси­на, который при попадании в кишечник личинок насекомых раз­рушается. Продукт данного ферментативного расщепления — 5-эндотоксин — вызывает гибель насекомых. Интерес к этой груп­пе белков вызван их широким спектром действия. Найдены но­вые классы эндотоксинов, которые токсичны к клещам, немато­дам, одноклеточным паразитирующим микроорганизмам и т.д. Более того, в настоящее время сконструирован искусственный ген Bt, более эффективный, с более широким спектром устойчивос­ти по сравнению с природным геном.

Другой путь повышения устойчивости растений к вредителям, в частности к фитопатогенным грибам, — это экспрессия в клет­ках растений генов — ингибиторов протеиназ. Для данной цели перспективно использование гетерологичных генов растений, так как многие ткани и органы растений содержат ингибиторы, спе­цифически настроенные против протеиназ насекомых и грибов, но безвредных для человека и животных.

Еще одно направление создания трансгенных устойчивых ра­стений связано с повышением их иммунитета. У устойчивых ра­стений в ответ на атаку патогенов происходит изменение метаболизма: накапливаются перекись водорода, салициловая кислота, фитоалексины — соединения, выполняющие защитную роль в растении. Поэтому существенное увеличение с помощью измене­ния генома уровня салициловой кислоты и других соединений в ответ на проникновение фитопатогена может стать перспектив­ным для получения устойчивых растительных организмов.

5.9. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

Адаптация растений в природе и, следовательно, их способ­ность к выживанию при неблагоприятных условиях среды обес­печиваются тремя способами. Во-первых, физиологические ме­ханизмы, позволяющие растениям избежать неблагоприятные воздействия (например, период покоя). Во-вторых, адаптация осу­ществляется благодаря морфологическим приспособлениям: толстому слою кутикулы на листьях, уменьшению листовой поверх­ности, ее опушению, которые предотвращают излишнюю потерю влаги растениями. В-третьих, негативное влияние внешней среды может быть преодолено с помощью изменений метаболизма. Именно этот последний адаптационный механизм наиболее дос­тупен для генно-инженерных исследований. Например, известно, что при водном стрессе у высших растений основным защитным механизмом, связанным с изменением метаболизма, является накопление в клетках пролина, глицинбеатина и других осмопротекгоров.

Экспериментально было показано, что стрессовый ответ у бак­терий и высших растений выражается сходно. И у растений, и у бактерий начинается усиленный синтез молекул осмопротекто­ров, механизм действия которых состоит в установлении осмоти­ческого баланса между цитоплазмой и окружающей средой, а так­же стабилизации белковых молекул. В бактериях биосинтез про­лина хорошо изучен, известны гены, кодирующие ферменты этого процесса. Избирательная экспрессия генов осмопротекторов мо­жет привести к увеличению адаптационных качеств растения и, следовательно, к увеличению его продуктивности. Поэтому следующим шагом на пути создания устойчивых к стрессам рас­тений было клонирование бактериальных генов, получение век­торных конструкций на основе Ti-плазмиды и введение их в рас­тения. Полученные трансгены синтезировали и накапливали пролин в 4—6 раз интенсивнее, чем обычные растения. Трансгенные побеги могли укореняться и расти при концентрации соли в сре­де 20 г/л (350 мМ).

У растений адаптация к низким температурам сопряжена с многочисленными физиологическими изменениями. При этом накапливаются растворимые вещества, понижающие осмотиче­ский потенциал клеток и уменьшающие вероятность образования крупных кристаллов льда. Кроме того, синтезируется большое количество белков с повышенным содержанием сульфгидрильных групп (-SH), которые обладают особо высокой способностью к гидратации, а гидратационная вода, как известно, практически не замерзает. Однако повышение устойчивости растений к замерза­нию с помощью методов генной инженерии началось с измене­ния генома не растений, а бактерий. Исследователи Колорадского университета (США) выяснили, что повреждению растений при замерзании способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) микрофлоры Pseudomonas syringae и Erwinia herbicola, белки ко­торых служат центрами кристаллизации. Если обезвредить бакте­рии стрептомицином, то растения не замерзают при температуре -8 С. Но стрептомицин дорог и вреден, поэтому выгоднее было изменить генетику данного штамма бактерий, вырезав из генома определенный ген. Растения, инфицированные мутантным штам­мом P. syringae, росли при отрицательной температуре. Однако оказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и спо­собны вытеснить природный штамм, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствует кристаллизации атмосферной вла­ги. Вероятно, уничтожение природного штамма могло бы приве­сти к экологической катастрофе.

Следует отметить, что работы по генетической инженерии, воз­можности манипулирования генами растений представляют ог­ромный интерес для фундаментальных исследований. Эти рабо­ты позволяют изучать основы молекулярной и клеточной биоло­гии растительной клетки, глубинные механизмы процессов, про­исходящих в ней. Вместе с тем нельзя не задуматься о своевре­менности прикладного применения результатов генно-инженер­ных исследований.

Источник