Способ виньяль вейона для анаэробов

Методы культивирования анаэробов

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в сред окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и би логических методов.

Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу , лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта-Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль-Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку.

В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль-Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом ( азотом , во­дородом , аргоном , углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3-4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Источник

Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

6.4. Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

1. Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 24 – 72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта – Тароцци.

2. Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 0,9 % раствором хлористого натрия, перемешивают и переносят в пробирку с охлажденным сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24 – 72 ч в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта – Тароцци или СКС.

3. Метод Вейона – Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки и запаивают их концы. После получения микробного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта – Тароцци или СКС.

4. Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стеклянная пластинка. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила все пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолированную колонию засевают в пробирку со средой Китта – Тароцци или СКС для получения чистой культуры.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином. Термостатируют при температуре 37 °C до появления изолированных колоний анаэробов.

Источник

Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов

Для культивирования анаэробов необходимо создать с помощью физических, химических и биологических методов условия анаэробиоза — пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве.

· механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы – анаэростатов (рис. 26, см. приложение), с помощью разрежающих насосов. Анаэростат представляет собой цилиндр из ударопрочного полимерного материала или металла с хорошо притертой крышкой, снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса;

· посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества, которые связывают растворенный в среде кислород. С целью уменьшения содержания кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, затем быстро охлаждают, после чего заливают небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Легко окисляемыми веществами являются глюкоза, лактоза и др. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая с успехом используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов;

· посев микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Для этого берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50 0 С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде;

· замена воздуха в анаэростатах или эксикаторах индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в анаэростате или эксикаторе такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия;

Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую — анаэробов. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом (через 3-4 дня) — анаэробы.

Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий от потенциального носителя золотистого стафилококка (самостоятельная работа). Продолжить работу по бактериологическому исследованию, начатую на предыдущем занятии: рассмотреть чашку с выросшими колониями и обвести карандашом по дну различные типы колоний, у которых изучить культу­ральные свойства в соответствии с таблицей 3.

Учитываются следующие признаки колоний:

· размер (измеряется миллиметровой полоской со стороны дна диаметр колонии);

· форма (круглая, неправильная);

· цвет (красный, желтый и т.д.). Беспигментные колонии имеют отте­нок среды, например сероватый на МПА;

· поверхность (выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, шероховатая);

· край (ровный, изрезанный, волнообразный, фестончатый). Колонии зарисовать.

Таблица 3. Характеристика колоний бактерий

Признаки колоний	Описание свойств колоний
Размер	Проводится измерение диаметра колоний
Форма	Круглая, неправильная
Цвет	Красный, желтый и т.д. Беспигментные колонии имеют оттенок среды, например, сероватый на МПА
Поверхность	Выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, морщинистая, шероховатая, исчерченная и т.д.
Структура	Чашка Петри с ростом колоний кладется дном вверх на предметный столик микроскопа и колония изучается у ее края при малом увеличении с опущенным конденсором. Структура может быть гомогенной, мелко-, крупно-, неравномерно-зернистой, волокнистой
Край	Изучается вместе со структурой. Может быть ровным, изрезанным, волнообразным, фестончатым
Консистенция	Определяется при взятии петлей для приготовления мазка. Консистенция может быть слизистой (культура тянется – подозрение на наличие капсулы), влажная (легко берется) и сухая (крошится – подозрение на спорообразующие бактерии)
Тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства	Изучаются соответствующие свойства бактерий, находящихся в колонии

Для дальнейшего изучения выбирают одну из колоний. С целью сохранения и накопления выделенной чистой культуры сделать пересев из колонии на скошенный МПА.

Техника пересева: снять крышку чашки, взять чашку в левую руку в вертикальном положении, посевом обратив к себе. Стерильной петлей взять из центра колонии культуру и засеять на скошенный МПА зигзагообразной линией, двигаясь снизу вверх. Прокалить петлю в пламени спиртовки, аккуратно подписать пробирку в верхней трети и поместить ее в термостат на сутки. Результаты исследования занести в протокол. Работа будет продолжена на следующем занятии.

6. Изучение методов культивирования анаэробов и ознакомление с аппаратурой, используемой с этой целью (демонстрация).

Культивирование анаэробов проводят в бескислородных условиях, для чего с целью удаления кислорода к питательным средам добавляют кусочки печени, а также редуцирующие вещества (сульфат железа, глюкоза и др.).

Наиболее широко в бактериологической практике применяются следующие методы культивирования анаэробов:

· Метод Вейнберга (на сахарном МПА столбиком). В расплавленный МПА в пробирке бактериологической иглой или петлей добавляют исследуемый материал, тщательно перемешивают содержимое пробирки, охлаждают. В нижней части пробирки создаются оптимальные условия для роста анаэробов,

· Метод Вейон-Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в нескольких пробирках с МПА, затем содержимое каждой пробирки набирают в специальную стеклянную трубку, один конец которой вытянут в виде капилляра (как у пастеровской пипетки), а другой конец имеет сужение. После заполнения трубки капилляр запаивают в пламени спиртовки, а суженную часть трубки закрывают кусочком ваты. Трубку охлаждают, помещают в термостат. Через 2-3 дня в столбике МПА вырастают колонии анаэробов. Напильником делают надрез выше уровня намеченной колонии, трубку надламывают, колонию извлекают из агара петлей и пересевают на среду Китт-Тароцци.

· Выращивание в анаэростатах — в металлических или пластмассовых сосудах с герметически закрывающейся крышкой, воздух из которых отсасывается с помощью разрежающего насоса или заменяется газовым составом.

· Создание анаэробных условий в эксикаторах (герметически закрывающиеся стеклянные сосуды) с использованием химических поглотителей кислорода или заменой кислорода инертным газом.

· Биологический метод культивирования анаэробов (по Фортнеру). На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую — анаэробов. Бортики чашки оклеивают лейко­пластырем, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом анаэробы.

2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий из почвы (демонстрация):

· изучение характера роста на среде Китт-Тароцци;

· изучение морфологических и тинкториальных свойств микроор­ганизмов, выросших на среде Китт-Тароцци; приготовление мазка, окраска его по Граму, микроскопия. Обратить внимание на наличие в микропрепарате крупных, расположенных беспорядочно или короткими цепочками, грамположительных палочек; выполнить посев одной петли материала со среды Китт-Тароцци в высокий столбик МПА, расплавленного на водяной бане и остуженного до 45° С. Результаты исследования занести в протокол.

3. Выделение чистой культуры протея по методу Шукевича (самостоятель­ная работа). Произвести посев исследуемого материала петлей в конденсацион­ную воду скошенного МПА. Ход исследования отразить в протоколе.

Источник