Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,— тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.
Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».
Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl — фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.
Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.
Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.
Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.
Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла (оливковое мыло), 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.
Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).
Упрощенный метод Ниссля
Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.
Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.
1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.
2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.
3. Дифференцируют в 96 % спирте.
4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.
5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.
6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.
7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.
Метод Ниссля в модификации Снесарева
Одновременно с нервными клетками на препаратах, окрашенных по Нисслю, выявляются клеточные элементы мягкой мозговой оболочки и ее сосудов, внутримозговых сосудов, ядра глии и инфильтративные клетки, липофусцин, зеленый пигмент, 6азофильные коагуляты в сосудах, протоплазменная реакция астроцитов. Метод Ниссля также может быть использован для предварительной диагностики нейроэктодермальных опухолей и паразитарных поражений мозга.
Срезы материала, залитого в целлоидин, получают на санном микротоме. Толщина срезов 8-10 мкм. Их хранят в 96 % спирте.
1. Срезы в 96 % спирте подогревают на водяной бане до появления пузырьков и охлаждают.
2. Переносят в 0,2 % раствор тионина, подогревают до появления паров и охлаждают.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды; проводят через 2 смены 96 % спирта (до побледнения срезов) по 30 —40 с в каждой.
4. При недостаточной дифференцировке тионина в спиртах проводят через эвкалиптовый спирт (10 мл 96 % спирта + 1 капля эвкалиптового масла) 3-5 с; тщательно ополаскивают в 3 сменах 96 % спирта, проводят через спирт-ксилол (2 части ксилола и 1 часть 96 % спирта), 100 % спирт-ксилол, ксилол.
5. Переносят на предметное стекло и заключают в бальзам.
6. Готовые препараты укладывают на доски и держат на свету до просветления фона (контроль под микроскопом).
Раствор тионина. Готовят из 1 г тионина и 500 мл дистиллированной воды. Тионин растирают в ступке в течение 45-60 мин, добавляя по каплям подогретую дистиллированную воду. Затем доливают оставшуюся дистиллированную воду, подогревают, доводят до кипения и фильтруют через 6 фильтров.
Перед использованием приготовленного раствора тионина его также следует профильтровать. Использованный краситель сливают в отдельный сосуд, так как он может быть вновь использован.
Результаты: на светлом фоне выявляются нервные клетки сине-фиолетового цвета различных оттенков.
Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются.
Источник
Окрашивание нервной ткани
Микроскопическая техника Гистологическая техника Гематоксилин Обзорные окрашивания Методы окраски тканей Окрашивание нервной ткани Окрашивание костной ткани Кровь: методы окраски Окрашивание азаном по методу Гейденгайна Микротом для парафиновых срезов МПС-2
Окрашивание нервной ткани
При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.
При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 — 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей — сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.
Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):
нейтральный формалин 15 мл
бромид аммония 20 г
дистиллированная вода 85 мл
Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю —Хортеге.
Продолжительность фиксации тонких (до 1,5 см) кусочков материала 2 — 15 дней.
Промывание в проточной воде.
Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):
96 % спирт 30 мл
Продолжительность фиксации 2 ч.
Промывание в проточной воде в течение 1 ч.
Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 —б мм используют следующую схему:
100 % спирт I 6 ч
100% спирт II 6 ч
Продолжительность обезвоживания 32 ч
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ
Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.
Заливка в желатин по Снесареву
Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.
Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12,5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.
После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12,5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5— 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.
Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток,— тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.
Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».
Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl — фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.
Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.
Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.
Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.
Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3,75 г метиленового синего В, 1,75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть!) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.
Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).
Окрашивание хроматофильной субстанции по методу Ниссля в модификации Майера
ТИОНИНА-2,0 и БОРНОЙ КИСЛОТЫ-1,0 г. растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, затем прибавляют несколько кристаллов тимола.
Перед употреблением раствор фильтруют.
Расправленные парафиновые срезы без наклейки на предметное стекло и без депарафинирования переносят в раствор тионина на 24 часа, при этом срезы должны плавать на поверхности красителя
Срезы вылавливают на предметное стекло, затем высушивают в термостате при 37″С. Депарафинируют срезы и заключают в канадский бальзам или полистирол
Ядрышко и хроматофильная субстанция цитоплазмы сине-фиолетового цвета
Упрощенный метод Ниссля
Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.
Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.
1. Расправленные срезы помещают в 0,1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.
2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.
3. Дифференцируют в 96 % спирте.
4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.
5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.
6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.
7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.
Метод Ниссля в модификации Снесарева
Одновременно с нервными клетками на препаратах, окрашенных по Нисслю, выявляются клеточные элементы мягкой мозговой оболочки и ее сосудов, внутримозговых сосудов, ядра глии и инфильтративные клетки, липофусцин, зеленый пигмент, базофильные коагуляты в сосудах, протоплазменная реакция астроцитов. Метод Ниссля также может быть использован для предварительной диагностики нейроэктодермальных опухолей и паразитарных поражений мозга.
Срезы материала, залитого в целлоидин, получают на санном микротоме. Толщина срезов 8-10 мкм. Их хранят в 96 % спирте.
1. Срезы в 96 % спирте подогревают на водяной бане до появления пузырьков и охлаждают.
2. Переносят в 0,2 % раствор тионина, подогревают до появления паров и охлаждают.
3. Промывают в 2 сменах дистиллированной воды; проводят через 2 смены 96 % спирта (до побледнения срезов) по 30 —40 с в каждой.
4. При недостаточной дифференцировке тионина в спиртах проводят через эвкалиптовый спирт (10 мл 96 % спирта + 1 капля эвкалиптового масла) 3-5 с; тщательно ополаскивают в 3 сменах 96 % спирта, проводят через спирт-ксилол (2 части ксилола и 1 часть 96 % спирта), 100 % спирт-ксилол, ксилол.
5. Переносят на предметное стекло и заключают в бальзам.
6. Готовые препараты укладывают на доски и держат на свету до просветления фона (контроль под микроскопом).
Раствор тионина. Готовят из 1 г тионина и 500 мл дистиллированной воды. Тионин растирают в ступке в течение 45-60 мин, добавляя по каплям подогретую дистиллированную воду. Затем доливают оставшуюся дистиллированную воду, подогревают, доводят до кипения и фильтруют через 6 фильтров.
Перед использованием приготовленного раствора тионина его также следует профильтровать. Использованный краситель сливают в отдельный сосуд, так как он может быть вновь использован.
Результаты: на светлом фоне выявляются нервные клетки сине-фиолетового цвета различных оттенков.
Метод Ниссля отличается постоянством и большой надежностью результатов. Основой его успешного использования являются правильная фиксация материала и, что особенно важно, тщательное обезвоживание в спиртах восходящей концентрации при заливке в целлоидин или парафин. При несоблюдении этих условий препараты дают неотчетливое изображение, имеют зеленый оттенок и быстро обесцвечиваются.
ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН
Методика выявления миелиновой оболочки по Шпильмейеру
Данная методика предназначена для элективного окрашивания миелиновых оболочек нервных волокон. Одновременно в белом веществе выявляется дренажная олигодендроглия.
Кусочки хранят в 10 % формалине, режут на замораживающем микротоме (толщина срезов 15 — 20 мкм). Срезы можно хранить также в 10 % формалине.
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
2. Переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, и подсушивают на воздухе.
3. Погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 сут (можно дольше) и держат в темном месте.
4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и обезжиривают в 96 % спирте 15 — 30 мин.
5. Помещают в гематоксилин (15 мл гематоксилина Бемера и 85 мл дистиллированной воды) на 1 сут и держат на свету.
6. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов (контролируя процесс под микроскопом).
7. Промывают в дистиллированной воде, затем оставляют на 30 мин в проточной воде.
8. Просушивают на воздухе, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Гематоксилин Бемера готовят из двух растворов. Первый раствор: 1 г гематоксилина в 10 мл абсолютного спирта; второй: 8 г алюмокалиевых квасцов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды, после чего раствор остужают и фильтруют. Через 1 сут после приготовления растворы смешивают и дают смеси созреть на свету в широкогорлом открытом сосуде 10—14 сут, после чего фильтруют и добавляют несколько кристаллов тимола.
Раствор железоаммонийных квасцов: 2,5 г железоаммонийных квасцов и 100 мл дистиллированной воды размешать и профильтровать.
Результаты: на светлом слегка желтоватом фоне миелиновые волокна темно-серо-синеватого оттенка; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе того же оттенка.
В одном препарате редко удается одновременно выявить касательные (тангенциальные) и проекционные волокна, потому что для выявления миелиновых волокон разных систем (интракортикальные, проекционные и спаечные) требуется различная длительность дифференцировки срезов в железоаммонийных квасцах. В связи с этим одно стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, с тем чтобы получить четкую архитектонику волокон, а также тонкую структуру миелиновой оболочки проекционных волокон, нужно более длительно дифференцировать в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов, тогда как для выявления архитектоники волокон и структуры миелиновой оболочки касательных (тангенциальных) волокон другое стекло со срезом, окрашенным гематоксилином, погружают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на более короткий срок. В процессе окрашивания могут появляться артефактные контрастные белые пятна неокрашенной ткани. В таких случаях срезы нужно более длительное время обезжиривать в 96 % спирте.
Метод Шпильмейера в модификации Соколянского
Данный метод применяют для выявления миелиновых оболочек нервных волокон. С его помощью более четко определяется волоконная архитектоника и структура волокна, но хуже окрашивается миелин. Одновременно окрашивается дренажная олигодендроглия в белом веществе (при окраске головного мозга крыс лучше применять модификацию Соколянского).
Материал фиксируют в формалине.
Срезы толщиной 10 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме.
1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
2. Переносят на смазанное белком покровное стекло и подсушивают.
3. Помещают в насыщенный раствор бихромата калия на 24 ч (можно на несколько суток) и держат на свету.
4. Ополаскивают в дистиллированной воде.
5. Переносят в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов и держат в темноте 24 ч (можно дольше).
6. Ополаскивают в дистиллированной воде (необязательно).
7. Окрашивают в течение 24 ч (можно дольше) на свету в гематоксилине (15 мл гематоксилина Бемера + 85 мл дистиллированной воды).
8. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.
9. Дифференцируют в 2,5 % растворе железоаммонийных квасцов.
10. Промывают в дистиллированной и проточной воде, проводят через 96 % спирт, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: на сероватом фоне миелиновая оболочка центральных нервных волокон сиреневая; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе такого же оттенка.
Выявление миелиновой и нейрокератиновой оболочек по Авцыну
Материал фиксируют в формалине, заливают в желатин. Срезы толщиной до 10 мкм отмывают от формалина в 2 сменах дистиллированной воды, затем помещают в спиртовой раствор пиридина (чистый пиридин + 96 % спирт в соотношении 1:1) на 1 сут.
1. Срезы промывают в 3 — 5 сменах дистиллированной воды и помещают в 0,5 % раствор нитрата серебра.
2. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.
3. Переносят в 10 % нейтральный формалин (3 порции, в каждой по 3 мин).
4. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.
5. Опускают в фосфорно-молибденовое серебро на 30 с.
6. Быстро ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.
7. Переносят в 10 % нейтральный формалин на 2 мин.
8. Погружают в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.
9. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (в той же банке).
10. Помещают в 10 % нейтральный формалин на 2 мин. И. Ополаскивают в дистиллированной воде.
12. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (так до 3 — 4 раз, а для выявления тангенциальных волокон — до 7 раз).
13. Переносят в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.
14. Осторожно натягивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином.
15. Подсушивают на воздухе 8—10 мин, проводят через ксилол и заключают в бальзам.
Для приготовления фосфорно-молибденового серебра берут 4 мл 20 % раствора нитрата серебра и 1 мл 1 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты, добавляют по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка, доливают до 15 мл дистиллированной воды.
Результат: на светло-сиреневом фоне определяются нейрокератиновая и миелиновая оболочки нервных волокон черного цвета; в сосудах выявляются эритроциты черного цвета.
Для получения этих результатов требуется тщательное соблюдение методических рекомендаций: свежий, прозрачный раствор фосфорно-молибденового серебра, соответствующей толщины срезы, химически чистая посуда. В противном случае фон становится интенсивно коричневым, а серебро, применяемое для выявления нервных волокон, выпадает в осадок в виде зерен черного цвета.
Выявление оболочек нервных волокон по Хеквисту
Материал (кусочки ткани размером до 3 см) фиксируют в формалине, продолжительность фиксации не ограничена. После фиксации кусочек промывают до исчезновения запаха формалина.
Затем кусочки помещают в 5 % раствор бихромата калия на 14 дней, промывают в проточной воде 24 ч, проводят через спирты (70 %, 96 % и 100 %) и заливают в парафин.
1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду.
2. Переносят в 0,5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды).
3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель.
4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам.
Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко-красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно-синий цвет.
Рисунок миелинового волокна может иметь размытый фон при задержке ополаскивания в воде.
ВЫЯВЛЕНИЕ ГАНГЛИЕВ И ИХ ОТРОСТКОВ
Среди методов импрегнации металлами первое место занимают методы импрегнации серебром Гольджи. Они основаны на образовании соединений серебра, которые осаждаются на отдельных ганглиозных клетках и их отростках, а также часто на глиальных клетках, сосудах и других образованиях. Наиболее распространен так называемый быстрый метод Гольджи. Во многих случаях вместо него можно использовать простой метод серебрения Шультце. Недостатком, но в то же время и достоинством метода Гольджи является то, что импрегнация никогда не распространяется на все клетки, ограничиваясь отдельными элементами. Благодаря этому получается картина, хотя и не полная, но более ясная, чем если бы были выявлены все клетки.
Метод Гольджи имеет большое значение не только для импрегнации нервных клеток, но и для выявления нервных окончаний, секреторных капилляров, железистых ходов, границ клеток и т.п. Хотя метод Гольджи позволяет получить лишь теневую картину, в соответствующих случаях с его помощью с успехом выявляют разнообразные тканевые элементы. При его использовании, конечно, нужно постоянно сознавать, что выявление структур основано на образовании осадка, который при известных обстоятельствах может дать картину не существующих в действительности структур. Нужно также учитывать, что выявленные клетки или структуры могут оказаться неполно импрегнированными. Какие именно образования будут импрегнированы, является в известной степени делом случая, так как условия, при которых происходит образование осадка, к сожалению, еще недостаточно известны. В связи с этим для правильной оценки полученных результатов требуются знания и опыт.
Ускоренный метод Гольджи
1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2,5 % (до 3,5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стеклянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Кусочки не должны быть слишком большими или слишком маленькими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).
Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.
2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0,75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до прекращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0,75 % раствора нитрата серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.
3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.
Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1:1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.
Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.
После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.
Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.
Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объектами являются головной и спинной мозг птенцов голубя.
Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2 — 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.
Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.
Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 — 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 — 3 % раствора бихромата калия и 4 —5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.
Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.
При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 — 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 — 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.
Медленный метод Гольджи
Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0,75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.
Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом
Оригинальная методика Гольджи
Данная методика является основной в изучении тонких структурных особенностей дендритов, шипиков и аксонной системы нейронов, позволяет более полно выявить морфологические особенности нейронов и межнейрональных связей.
1. Кусочки ткани мозга фиксируют в 10 % формалине от 1 до 15 дней. Увеличение продолжительности фиксации в формалине ухудшает качество импрегнации. Толщина кусочков не должна превышать 3 — 3,5 мм.
2. Фиксированные в 10 % формалине кусочки переносят (без промывания) на 3 сут в жидкость Мюллера в термостат.
3. Помещают (без промывания) в фиксатор, состоящий из 5 мл 1 % тетраоксида осмия и 25 мл 3 % бихромата калия, который готовят непосредственно перед использованием, ставят бюкс с притертой крышкой на 2 дня в термостат при температуре 37 °С. Для фиксации одного кусочка требуется не менее 30 мл указанной смеси.
4. Промывают кусочки в 2 сменах 1 % раствора нитрата серебра, приготовленного на 20 % растворе глюкозы.
5. Кусочки переносят в баночки из темного стекла на стеклянную вату и осторожно наливают раствор нитрата серебра на глюкозе (на 1 кусочек примерно 40 — 50 мл раствора). Обращаться с кусочками следует с большой осторожностью: брать их можно только пластмассовой или стеклянной лопаточкой, не следует пользоваться металлическим шпателем. Импрегнацию кусочков проводят в течение 14 — 20 дней в теплом месте.
