В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
В микроскоп входят 3 системы —
оптическая, осветительная и механическая.
1.Оптическая система включает объектив и окуляр.
а ) Объектив (1) — это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда — и название).
Обычные увеличения объектива:
8 , 20 , 40 (сухие объективы),
90 (иммерсионный объектив).
Схема — строение светового микроскопа.
Полный размер
При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением 7, 10, 15.
в) Результирующее увеличение микроскопа — произведение увеличений объектива и окуляра, например:
20 10 = 200 раз.
г) Таким образом, функция оптической системы —
формирование увеличенного изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
2. Осветительная система — источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример — обычная настольная лампа).
б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.
Одна поверхность зеркала — плоская, вторая — вогнутая; последняя используется при искусственном освещении.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине.
Она ограничивает световой поток, падающий на препарат. При использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует уменьшить — для ослабления сферической аберрации.
3. Механическая система — тубус (2) , штатив (8) , колонка (9) и предметный столик (10) .
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты .
Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на сетчатке глаза наблюдателя.
Макровинт используется при работе на малом увеличении, а микровинт — на большом.
б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат объектив (1) тубус (2) окуляр (3) .
Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете , для чего препарат должен быть достаточно тонким. Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение объекта.
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:
а) срезы органов (толщиной 5-15 нм), б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки), в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты
Чаще всего используются срезы.
2. Приготовление препарата обычно включает 4 следующих этапа:
а) взятие и фиксация материала, б) обезвоживание и уплотнение материала, в) приготовление срезов, г) окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду.
1.1.2.1. Взятие и фиксация материала
1. Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, метанол и т.д.) — обычно на 24 ч.
2. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков .
3. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов.
1.1.2.2. Обезвоживание и уплотнение материала
1. Затем образцы уплотняют — чтобы в последующем их можно было резать на микротоме. Часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин.
2. Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).
а) Для этого их “проводят” по батарее спиртов —
70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол — по 24 часа в каждом спирте.
б) Т.к. парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле.
3. Заливка : помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин
Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом и закрепляют на деревянном кубике.
1.1.2.3. Приготовление срезов
1. Кубики вставляют в специальный прибор — микротом , — служащий для приготовления срезов.
2. а) С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (напр., 10 мкм).
б) А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины.
3. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем — на предметное стекло.
1.1.2.4. Окрашивание препаратов и заключение в консервирующую среду
1. Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина , проводя по батарее растворителей:
ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин)
(Этот ряд кончается водой в том случае, если затем используется водорастворимый краситель.)
2. Для окрашивания предметные стёкла со срезами
помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой.
3. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) — для удаления лишней краски.
4. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.
1.1.2.5. Мазки и тотальные препараты: особенности приготовления
1. Примеры тотального препарата — участки сальника или мягкой мозговой оболочки, растянутые на предметном стекле.
2. В подобных случаях, а также при приготовлении мазков, из 4-х перечисленных в п. 1.1.2. этапов опускаются два —
уплотнение материала и приготовление среза (с последующим освобождением от уплотнителя).
фиксация, окраска и заключение в консервирующую среду.
В остальных же случаях (т.е. при получении срезов) приготовление гистологического препарата — весьма долгая и трудоёмкая процедура. Но при правильном её выполнении полученный препарат может храниться неопределённо долгое время.
1.1.3. Методы окрашивания гистологических препаратов
1.1.3.1. Типы красителей
Все красители, используемые в гистологической технике, подразделяются на 3 типа.-
Тип красителя
Пример
Окрашиваемые структуры
Кислые красители
Кислоты и кислые соли :
эозин (искусственная краска; название — от греч. эос — заря);
кислый фуксин .
а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям).
б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители
Основные с оли :
гематоксилин (точнее, продукт его окисления — гематеин);
азур 2, кармин.
а) К расящиеся структуры — базофильные (сродство к основным красителям).
б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами — ядра, рибосомы, аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители
Смесь двух красителей:
основного ( азур 2 ) и кислого ( эозин ).
а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример — специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах.
б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индифферент- ные красители
Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется).
Существует большое количество различных способов окраски. Те из них, которые встречаются в нашем курсе, перечислены ниже.
1.1.3.2. Общие методы окраски
1. Окраска гематоксилин -эозином
1. а) Самый распространённый метод окраски.
б) Сочетает основной и кислый красители.
в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры.
2. Ядра пр иобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма — желтовато-розовый цвет.
3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
2. Окраска железным гематоксилином (по методу Генденгайна)
1. Препарат
предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином.
а) Краситель — смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина.
б ) Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвет , а элементы других тканей (напр., мышечные волокна) — в жёлтый цвет.
2.а ) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет ;
б) многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) — в оранжевый или красный цвет.
3.Импрегнация серебром
1. а) Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем — восстановителями.
б) В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани. –
2.Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрный цвет, коллагеновые волокна — коричневый , ядра клеток — светло-коричневый .
4. Окраска орсеином
Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет ;
остальные структуры — в слабо-розовый цвет .
5. Окраска гематоксилин- пикрофуксином
Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет ,
коллагеновые волокна — в красный цвет ,
ядра клеток — окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет.
6. Окраска по методу Шморля
1. Используется для окраски костей и дентина.
2. а) Предварительно кусочки материала подвергают декальцинации (с помощью кислоты), а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов.
б) Краситель — раствор тионина.
3 . а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет;
б) остальной фон — светло-коричневый .
1.1.3.4. Окраска клеток соединительной ткани и крови
1. Окраска азур 2 – эозином
Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий,
а оксифильные — в светло-красный цвет.
2. Окраска мазков по методу Романовского
1. а) Краситель — тот же, что и в предыдущем случае (азур 2 – эозин).
б) Отличия же от приготовления срезов таковы:
фиксацию мазков проводят чистым метанолом ; окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не 12-14 ч; для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам.
2. Эритроциты приобретают бледко-красный цвет,
цитоплазма лейкоцитов — голубой или синий цвет,
цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.
1.1.3.5. Выявление элементов нервной системы
1.Импрегна- ция нитратом серебра
1. Особенности предварительной обработки препарата.-
Фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней .
Уплотнение образца осуществляют не путём заливки в парафин (или целлюлозу), а путём замораживания .
Срез готовят на специальном замораживающем микротоме.
2. При окрашивании срез последовательно обрабатывают растворами
3. а) Элементы нервной системы (волокна, клетки и т.д.) окрашиваются в чёрный цвет, б) окружающие ткани — в светло-коричневый цвет.
2. Окраска толуидино- вым синим по методу Ниссля
1. Толуидиновый синий окрашивает умеренно базофильные соединения в синий цвет.
2. С его помощью в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля).
3. Окраска метиловым зелёным- пиронином по методу Браше
1. Метод служит для выявления РНК .
2. а) Как и предыдущий метод, относится к гистохимическим методам исследования. б) Поэтому подробней описывается ниже.
1.1.4. Гистохимические методы исследования
а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. б) Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива.
1а) РНК
Реакция Браше.
1. Реактив (как отмечалось, — смесь двух красителей: метилового зелёного и пиронина.
2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет . Б. Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые участки цитоплазмы имеют красный цвет.
б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) — зелёные .
3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой.
1б) ДНК
Реакция Фёльгена.
1. Основной реактив — фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа).
2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет .
2. Белки
Используются различные реакции; в том числе:
а) с бромфеноловым синим (у белков — тёмно-фиолетовая окраска ); б) со смесью нингидрин-реактив Шиффа (белки приобретают красный цвет ).
3а) Полисахариды
ШИК-реакция.
1. Реактив — Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ).
2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа.
3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет .
3б) Гликозамин- гликаны
Реакция с толуидиновым синим.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия
— изменение окраски с синей на фиолетовую и красную.
2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани — гликозамингликаны
(являющиеся, как известно, гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
4. Нейтральный жир
Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось).
Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя.
1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1).
2. а) Ядра клеток (2) — базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет.
б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет.
1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III — гематоксилином
2. Препарат — белая жировая ткань. Тотальный препарат сальника. Окраска судан III -гематоксилином.
1. а) Препарат является тотальным.
б) Это означает, что перед нами — не срез органа, а участок сальника, растянутого на предметном стекле.
2. а) Жировые клетки на препарате заполнены крупными каплями жира (1) , которые окрашены суданом Ш в ярко-оранжевый цвет.
Полный размер
б) Клеточные ядра (2) , окрашенные гематоксилином в фиолетовый цвет, оттеснены к периферии клетки.
1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю
3. Препарат— пластинчатая костная ткань.Поперечный срез трубчатой кости. Окраска по методу Шморля.
1. В процессе изготовления препарата костный материал подвергнут декальцинации (п. 1.1.3.3).
2. Применённый метод окраски позволяет выявить стенки костных полостей (1) и канальцев (2) , окрашивающиеся в тёмно-коричневый цвет благодаря высокому содержанию здесь коллагеновых волокон.
3. В костных полостях находятся тела костных клеток (остеоцитов), а в канальцах — отростки этих клеток.
1.1.5.4. Срез; окраска по Маллори
4. Препарат — срез яичника кролика.Окраска по методу Маллори.
1. В методе Маллори используются 3 красителя (п. 11.3.3), что делает картину многоцветной.
2. На снимке — женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника.
3. Цитоплазма (1) клетки окрашена в розовый ,
окружающая её блестящая оболочка (2 ) — в голубой ,
а ядра фолликулярных клеток (3) — в фиолетовый цвет.
1.2. Электронная микроскопия
Если в световом микроскопе увеличение составляет 100-1000 раз, то в электронном микроскопе — 10.000 –100.000 раз (и выше), т.е. примерно в 100 раз больше .
1 . В электронном микроскопе образец облучается не видимым светом, а пучком электронов .
Длина же электронной волны значительно меньше, чем световой. Соответственно, такая волна “чувствует” меньшие препятствия: разрешающая способность микроскопа оказывается выше.
2. Конструктивная же особенность состоит в том, что в электронном микроскопе в качестве линз используются электромагнитные катушки.
Внешний вид электронного микроскопа
1.2.1.2. Ход лучей
Ход лучей в электронном микроскопе, в принципе, таков же, как в световом.-
1. а) Источником электронов служит катод (1) ,
а движущей силой — разность потенциалов между катодом и анодом (2).
б) Анод расположен вблизи катода и имеет отверстие посередине, через которое проскакивают электроны.
в) Чтобы их поток далее не ослабевал, в тубусе микроскопа создаётся высокий вакуум .
Схема — ход лучей в световом (I) и электронном (II) микроскопе.
I
II
Полный размер
2 . а) Одна электромагнитная катушка (3) служит в качестве конденсора (фокусирует пучки на образце (4) ),
б) вторая катушка (5) — в качестве объектива (принимает лучи, расходящиеся от образца),
в) а третья катушка (6) — в качестве окуляра, или проекционной линзы.
3 . Лучи, проходящие через последнюю катушку, попадают далее на люминесцентный экран (7) и вызывают его свечение в месте падения электронов.
1.2.2. Особенности приготовления препарата
1. Взятие материала и фиксация
Материал берут очень маленькими кусочками (порядка 1 мм 3 ), а фиксацию осуществляют обычно в 2 стадии:
вначале глутаральдегидом (стабилизация белков),
затем — четырёхокисью осмия ( стабилизация фосфолипидов и контрастирование ткани).
2. Уплотнение материала
1. Образцы, как обычно, обезвоживают, а для их дальнейшего уплотнения используют эпоксидные смолы .
2. а) Заливку производят в специальных формах,
б) затвердевание смеси происходит путём её полимеризации в термостате,
в) и затвердевшие блоки имеют вид маленьких свечей .
3. Приготовление срезов
1. Срез делают с помощью ультратома ; их толщина — 30-50 нм (ср. с микротом ными срезами — 10.000 – 20.000 нм).
2. Затем их переносят на сеточки (играющие роль предметного стекла).
4. Окрашивание срезов
1. а) Окрашивание срезов сводится к их контрастированию с помощью солей тяжёлых металлов (свинца, вольфрама, урана).
б) Эти соли осаждаются на фосфолипидах мембран и поглощают электроны.
8 , 
зеркало (5) 
Базофильные элементы окрашиваются азуром 2 в тёмно-синий, 
азотнокислого серебра,
