Методы создания рекомбинантных ДНК
1. Расщепление ДНК рестриктазами.В качестве мишеней рестриктаз выступают палиндромы из 4-6 пар оснований. Это сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, и образуются «тупые» концы», другие – со сдвигом, образуются «липкие» концы (фрагменты имеют на концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида). Полученные фрагменты используют для создания рекомбинантных ДНК.
2. Секвенирование нуклеотидов. Фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, отделяют электрофорезом и исследуют каждый из них отдельно. Строят рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.
3. Конструирование рекомбинантной ДНК. Плазмиды выделяют из E.coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктаз. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединяются «липкими» концами. Далее с помощью лигаз вновь получают кольцевую молекулу ДНК, которая вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это рекомбинантная ДНК.
— сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно-лигазный метод) – комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований; для восстановления разрывов используют ДНК-лигазу;
— сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод) – тупые концы соединяют ДНК-лигазой, при этом эффективность реакции меньше, чем при сшивке «липкими» концами;
— сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами – применяют линкеры, т.е. химически синтезированные олигорибонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию (существуют линкеры «тупой конец – липкий конец»); так получают очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.
4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:
— клонирование ДНК in vivo: к культуре E.coli добавляют рекомбинантные плазмиды, которые включаются в бактериальные клетки, и получают рекомбинантные буктерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий выделяют клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них – исследуемый фрагмент ДНК. Так выделяют ген или любой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей;
— аплификация (увеличение числа копий) ДНК in vitro: в 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, получивший название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических праймера. Праймеры ориентированы так, чтобы синтез с помощью полимеразы протекал только между ними. Тем самым происходит удвоение копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют «ампликоном». Амплификация заключается в повторяющихся циклах и является трехступенчатым процессом: 1 – денатурация ДНК при 95 °С; 2 – отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); 3 – достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при 70-75 °С. Продолжительность указанного цикла – менее 3 минут. Т.е., за 2 часа получают около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК.
Применение ПЦРв медицинской практике – диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания (в частности, для ранней диагностики ВИЧ); для анализа индивидуальных сперматозоидов и пр.
5. Введение гена в клетку.
Ген водят двумя способами так, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, и интегрировался с геномом клетки.
Вектор, молекула ДНК или РНК, состоящая из векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-реципиент и встроить ее в геном. В состав вектора входит маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Выделяют 2 группы маркерных генов: селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам; репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко тестируется. За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые встраивают в каждую векторную молекулу. Для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены контролировались прокариотическими регуляторными элементами.
— бактериальные плазмиды – наиболее часто используемая для клонирования плазмида pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E.coli;
— вирусы – есть вирусы, не ведущие к гибели клетки, но встраивающиеся в геном клетки-хозяина, и размножающиеся вместе с ней, либо вызывающие ее неконтролируемый рост (превращение в раковую);
— гибридные векторы – содержат ДНК фага и плазмиды: космиды и фазмиды.
2 способ. Трансформация (прямое введение гена в клетку):
— трансфекция: ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция, которые поглощаются клеткой путем фагоцитоза;
— микроинъекции ДНК микропипетками и микроманипулятором;
— электропорация – импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран;
— «мини-клетки», получаемые блокированием донорных клеток в митозе колцемидом. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются микроядра («мини-клетки»), инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия;
— упаковка в лизосомы – защита экзогенного генетического материала от действия рестриктаз;
— метод биолистики – один из самых эффективных методов трансформации растений: на частички вольфрама напыляются ДНК-векторы. Частички помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.
С развитием генной инженерии стало возможным заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно: интерферон, инсулин, соматостатин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др.
Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов и модифицировать генетический аппарат клетки.
Генотерапия – лечения заболеваний с помощью генов. Существует два типа генотерапии:
— заместительная генотерапия: в клетку вводят неповрежденный ген;
— корректирующая генотерапия: дефектный ген заменяют нормальным в результате рекомбинации.
Генотерапию используют для коррекции нарушений при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшена (заболевание мальчиков, связанное с дефектом Х-хромосомы): нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, вкалывают в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо аденовирусный вектор, и ребенок приобретает способность двигаться. Однако пока удалось получить только временный терапевтический эффект, и поэтому процедура введения гена должна повторяться неоднократно.
Муковисцидоз – наследственное заболевание легких, поражающее в Центральной Европе одного новорожденного из 2500. Для него установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление этого гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.
Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами СПИДа. ВИЧ – ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса.
Получение трансгенных животных. Для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. Микроинъекцию клонированных генов производят в оплодотворенную яйцеклетку, затем ее имплантируют в яйцевод приемной матери. Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение.
В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови. Создан трансгенный крупный рогатый скот, в молоке которого содержится человеческий альбумин: каждая корова производит до 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина в год.
Трансгенных животных получают для трансплантации органов. Лучшие доноры органов – свиньи, т.к. имеется анатомическое сходство органов и иммунологическийх свойств. Реакции отторжения органов при трансплантации имеют сложный механизм, и одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.
Источник
Рекомбинантная ДНК: описание, характеристики
Рекомбинантная ДНК — это молекулы, образованные лабораторными методами генетической рекомбинации для объединения генетического материала из множества источников. Она возможна потому, что молекулы ДНК всех организмов имеют одинаковую химическую структуру и отличаются только нуклеотидной последовательностью в ее пределах.
Создание
Молекулярное клонирование — это лабораторный процесс, используемый для создания рекомбинантной ДНК. Это один из двух наиболее широко используемых методов, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Он позволяет управлять репликацией любой конкретной последовательности ДНК, выбранной экспериментатором.
Есть два фундаментальных различия между методами рекомбинантных ДНК. Одним из них является то, что молекулярное клонирование включает репликацию в живой клетке, а ПЦР — в пробирке. Другое отличие состоит в том, что первый метод допускает вырезание и вставку последовательностей ДНК, а второй усиливается путем копирования существующей очередности.
Вектор ДНК
Получение рекомбинантной ДНК требует клонирующего вектора. Он происходит от плазмид или вирусов и представляет собой относительно небольшой сегмент. Выбор вектора для молекулярного клонирования зависит от выбора организма-хозяина, размера клонируемой ДНК и от того, должны ли экспрессироваться чужеродные молекулы. Сегменты могут быть объединены с использованием различных методов, таких как клонирование рестриктазы / лигазы или Сборки Гибсона.
Клонирование
В стандартных протоколах клонирование включает семь этапов.
- Выбор организма-хозяина и вектора клонирования.
- Получение ДНК-вектора.
- Формирование клонируемой ДНК.
- Создание рекомбинантной ДНК.
- Введение ее в организм хозяина.
- Отбор организмов, ее содержащих.
- Выбор клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.
После трансплантации в организм хозяина чужеродные молекулы, содержащиеся в рекомбинантной конструкции, могут экспрессироваться или неэкспрессироваться. Экспрессия требует реструктуризации гена для включения последовательностей, которые необходимы для продуцирования ДНК. Она используется трансляционным аппаратом хозяина.
Как работает
Рекомбинантная ДНК работает, когда клетка-хозяин экспрессирует белок из рекомбинантных генов. Экспрессия зависит от окружения гена набором сигналов, которые обеспечивают инструкции для его транскрипции. Они включают в себя промотор, связывание рибосомы и терминатор.
Проблемы возникают, если ген содержит интроны или сигналы, которые действуют как терминаторы для бактериального хозяина. Это приводит к преждевременному прекращению. Рекомбинантный белок может быть неправильно обработан, свернут или подвергнут разложению. Его производство в эукариотических системах обычно происходит в дрожжах и нитчатых грибах. Использование животных клеток затруднено из-за того, что многим нужна прочная опорная поверхность.
Свойства организмов
Организмы, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, имеют явно нормальные фенотипы. Их внешний вид, поведение и метаболизм обычно не изменяются. Единственный способ продемонстрировать наличие рекомбинантных последовательностей — это исследовать саму ДНК с использованием теста полимеразной цепной реакции.
В некоторых случаях рекомбинантная ДНК может оказывать вредное воздействие. Это может случиться, когда ее фрагмент, содержащий активный промотор, располагается рядом с ранее молчащим геном клетки-хозяина.
Использование
Технология рекомбинантной ДНК широко используется в биотехнологии, медицине и исследованиях. Ее белки и другие продукты можно найти практически в каждой западной аптеке, ветклинике, кабинете врача, медицинской или биологической лаборатории.
Наиболее распространенным применением является фундаментальное исследование, в котором технология важна для большинства современных работ в биологических и биомедицинских науках. Рекомбинантная ДНК используется для идентификации, картирования и последовательности генов, а также для определения их функции. Зонды рДНК используются для анализа экспрессии генов в отдельных клетках и в тканях целых организмов. Рекомбинантные белки используются в качестве реагентов в лабораторных экспериментах. Некоторые конкретные примеры приведены ниже.
Рекомбинантный химозин
Найденный в сычуге, химозин представляет собой фермент, необходимый для производства сыра. Это была первая генетически модифицированная пищевая добавка, используемая в промышленности. Микробиологически продуцированный рекомбинантный фермент, структурно идентичный ферменту, полученному от теленка, стоит дешевле и производится в больших количествах.
Рекомбинантный человеческий инсулин
Практически полностью заменил инсулин, полученный из животных источников (например, свиней и крупного рогатого скота) для лечения инсулинозависимого диабета. Рекомбинантный инсулин синтезируется путем введения гена человеческого инсулина в бактерии рода этерихий или дрожжи.
Гормон роста
Назначается пациентам, у которых гипофиз генерирует недостаточное количество гормона роста для поддержания нормального развития. До того, как стал доступен рекомбинантный гормон роста, его получали из гипофиза трупов. Эта небезопасная практика привела к тому, что у некоторых пациентов развилась болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Рекомбинантный фактор свертывания крови
Это свертывающий кровь белок, который вводят пациентам с формами гемофилии с нарушением свертываемости крови. Они не способны продуцировать фактор VIII в достаточных количествах. До разработки рекомбинантного фактора VIII белок получался путем обработки большого количества крови человека от нескольких доноров. Это несло очень высокий риск передачи инфекционных заболеваний.
Диагностика заражения ВИЧ
Каждый из трех широко используемых методов диагностики ВИЧ-инфекции был разработан с использованием рекомбинантной ДНК. Тест на антитела использует ее белок. Он определяет наличие генетического материала ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Разработка теста стала возможной благодаря молекулярному клонированию и анализу последовательности геномов ВИЧ.
Источник
