Получение рекомбинантного инсулина
• Инсулин — пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.
• Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь — из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков
• Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.
• При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина — проинсулин.
• Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.
• С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.
• До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота
Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.
Молекула инсулина состоит из двух цепей А-цепь – 21 аминокислота и В- цепь – 30 аминокислот. Молекула стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые необходимы для ее нормального функционирования. В организме человека и животных синтезируется проинсулин, в котором А и В-цепи соединены С-пептидом. После синтеза С-пептид выщепляется под действием протеолитических ферментов с образованием инсулина.
До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:
1)недостаток поголовья скота;
2)сложности хранения и транспортировки сырья;
3)трудности выделения и очистки гормона;
4)возможность развития аллергических реакций.
Все это сделало необходимым поиск альтернативных источников получения препарата. До настоящего времени единственным вариантом такого получения является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных микроорганизмов.
В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:
1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;
Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.
2) генно-инженерным способом;
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2.2) — получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).
Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.
• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).
• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.
• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
• 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.
• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.
Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.
• В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:
• Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.
• С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.
• Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.
• Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.
• В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.
• Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.
Источник
Получение рекомбинантного инсулина
Презентация на актуальную тему «Получение рекомбинантного инсулина». В работе рассмотрена тема получения инсулина. История открытия и способы получения гормона. Применение технологии в современном мире.
Скачать:
| Вложение | Размер |
|---|---|
| poluchenie_rekombinantnogo_insulina.pptx | 521.65 КБ |
Предварительный просмотр:
Подписи к слайдам:
Департамент образования , науки и молодежной политике Воронежской области Государственное бюджетное образовательное учреждение Воронежской области > Получение рекомбинантного инсулина. Выполнил студент очного отделения 2 курса Группы 3-2 Швалев Д . Л . Проверила : преподаватель Волкова Е . В .
Инсулин Инсулин-белковый (пептидный) гормон животных и человека, вырабатываемый клетками островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника — препроинсулина , состоящего из 109 аминокислотных остатков
Значение инсулина Инсулин понижает содержание сахара в крови, задерживая распад гликогена в печени и увеличивая использование глюкозы мышечными и другими клетками. Недостаток инсулина приводит к развитию такого заболевания, как сахарный диабет.
Первичная структура инсулина Первичная структура инсулина у разных биологических видов несколько различается, как различается и его важность в регуляции обмена углеводов. Наиболее близким к человеческому является инсулин свиньи, который различается с ним всего одним аминокислотным остатком: в 30 положении B-цепи свиного инсулина расположен аланин , а в инсулине человека — треонин
Превращение инсулина свиньи в инсулин человека В 1972 г. был разработан метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина на остаток треонина . В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 % чистоты . Ограничения использования этого метода связаны с ограниченностью сырьевой базы — поджелудочной железы телят и свиней, поскольку для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг исходного сырья .
История развития В 1980 г. У.Гилберт с сотрудниками выделили мРНК инсулина из опухоли β-клеток поджелудочной железы крысы и с помощью обратной транскриптазы получили рДНК Полученную рДНК встроили в плазмиду pBR322 Е. coli , в среднюю часть гена пенициллиназы . Рекомбинантная плазмида содержала информацию о структуре проинсулина .
Синтез Белка Рекомбинантный белок синтезировался бактериями внутриклеточно в виде так называемых телец включения, которые представляют собой агрегаты целевого белка в денатурированном неактивном состоянии . Благодаря этому целевой белок, находясь в нерастворимом состоянии, не подвергается протеолизу цитоплазматическими ферментами.
Процесс получения инсулина Процесс получения инсулина включал следующие стадии: 1. Ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере); 2. Отделение биомассы (клеток продуцента) методом центрифугирования; 3. Разрушение клеток с выделением телец включения; 4. Очистка рекомбинантного белка
Мировой рынок инсулина Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly (США). Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 5000 кг.
Источник
Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина человека, используемого для приготовления лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета. Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%. После разрушения клеток дезинтеграцией тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, затем добавляют дитиотреитол. Ренатурацию гибридного белка инсулина проводят в одну стадию путем инкубации в 5-10-кратном объеме буфера до стадии очистки путем кислотного осаждения. Гибридный белок хроматографируют на КМ-сефарозе. Ферментативное расщепление осуществляют последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок — 1:(500-1000). Между стадиями расщепления гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б проводят хроматографию на СП-сефарозе. Инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и выделением в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет упростить получение высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и повысить его выход в промышленном масштабе. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного инсулина человека для приготовления лекарственных форм различного срока действия при лечении сахарного диабета.
Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий процессы углеводного обмена и поддержание нормального уровня сахара в крови. Потребности в данном препарате не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы. Кроме того, существует необходимость в использовании при лечении диабета различных препаратов инсулина. Поэтому разработка способов получения инсулина из рекомбинантных штаммов микроорганизмов является актуальной медицинской задачей.
Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами (1). Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Авторам удалось добиться высокой продуктивности штамма-продуцента за счет использования ими разработанной богатой питательной среды. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-Sepharose, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. Недостатками данного способа являются:
использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 ч) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.
Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, заключающийся в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Escherichia coli ДН5
/рVК100, разрушают бактериальные клетки дезинтеграцией, отделяют фракцию телец включения, содержащих гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитола, 0,1 М трис НСl, рН 8,0, в течение 12-16 ч. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4
С в течение 1 ч. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, на рН-метре доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 ч при 4С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, для чего быстро растворяют в холодной воде при рН 10-12, а затем разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис НСl буфере, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б в соотношении 0,3:1:10 (белок карбоксипептидазы Б : белок трипсинат:гибридный белок) при 37С в течение 30 мин. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь немедленно подвергают хроматографической очистке на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-25 и элюируют 0,05 М трис НСl буфером, рН 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1M. После испарения изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25% и сдвигают рН до 2,0, добавляя 4 N соляную кислоту. Собирают осадок целевого продукта — инсулина (2).
Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков.
Использование гель-фильтрации на начальных стадиях вызывает значительные сложности при масштабировании процесса очистки, так как требует больших объемов сорбента. В полученном таким образом материале должны содержаться примеси небелковой природы, о которых не сообщается. Они могут существенно затруднить проведение регенерации сорбента. Известно также, что при расщеплении гибридного белка трипсином наряду с аргинин- и диаргинининсулином образуется и дезтреонининсулин из-за наличия лизина в положении 29 В-цепи инсулина. Разделение дезтреонининсулина и инсулина представляет определенную проблему из-за близости свойств данных полимеров. Авторы не сообщают, анализировалось ли содержание дезтреонининсулина, хотя при столь высоком соотношении трипсин : гибридный белок (1:10) вероятность его накопления в препарате очень велика.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером рН 5,0-6,0, содержащим 8 М мочевину, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией (3).
К недостаткам способа следует отнести использование значительного количества мочевины на стадии хроматографии на СП-сефарозе и использование органических растворителей на стадии выделения рекомбинантного инсулина.
Задачей изобретения является создание промышленной технологии получения высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека, позволяющей легко проводить масштабирование процесса и сократить до минимума число технологических операций производства продукта.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения рекомбинантного инсулина человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений подкислением до рН 4,0-6,0 с последующей хроматографией надосадочной жидкости на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0-6,0, содержащим 3 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией и выделяют инсулин в присутствии солей цинка.
Разработанная авторами определенная последовательность и сочетание технологических приемов выделения и очистки позволяют получить высокоочищенную субстанцию рекомбинантного инсулина человека с чистотой не ниже 98% и содержанием бактериальных пептидов и проинсулина требуемого уровня ( 2 площади поперечного сечения колонки в час. После введения раствора инсулина в колонку подают элюент, 1 М раствор уксусной кислоты, с той же скоростью. Раствор 1 М уксусной кислоты пропускают через колонку с носителем до отсутствия поглощения в ультрафиолетовой части спектра при 277 нм. Фракции белка объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на выходной кривой распределения субстанции инсулина, спектрофотометрически определяют содержание белка и биологическую активность, которая составляет не менее 27,5 Ед/мг инсулина.
Таким образом, проведение хроматографической очистки на нейтральных носителях позволяет получить инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не ниже 27,5 Ед/мг.
Подлинность полученного целевого продукта подтверждена по следующим параметрам:
— по совпадению времени удержания основного пика целевого продукта и международного референс-стандарта USP (Фармакопея USP 23, США);
— по определению биологической активности целевого продукта (ВФС 42-3045-98), которая составляет не менее 27 Ед/мг;
— по совпадению пептидных карт целевого продукта и референс-стандарта USP. Чистота полученного целевого продукта подтверждена по фармакопее USP 23, США и составила:
— по содержанию целевого продукта, определяемого методом ВЭЖХ, не менее 98%;
— по содержанию проинсулина, менее 10 ррм;
— по содержанию бактериальных пептидов, менее 10 ррм;
— по содержанию дезамидоинсулина, менее 2%.
1. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. 1996, Journal of biotechnology, v.48, p.241-250.
2. Chen J. — Q., Zhang H. — T., Ни М. — Н., Tang J.-G. Production of human insulin in an E. coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v.55, p.5-15.
3. Калинин Ю.Т., Ураков Н.Н., Иванов В.Т. и др. Способ получения рекомбинантного инсулина человека., Патент на изобретение RU 2141531 от 26.05.99.
1. Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма — продуцента E.coli JM 109/рРIНS07 в углеводосодержащей питательной среде, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок инсулина, их растворение в буфере, содержащем мочевину, ренатурацию, кислотное осаждение, и очистку гибридного белка хроматографией на КМ-сефарозе, ферментативное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в промышленном ферментере, при этом концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне (40±15)%, тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, с последующим добавлением дитиотреитола, ренатурацию белка осуществляют в одну стадию путем инкубации в глицин-NaOH буфере до стадии кислотного осаждения, расщепление гибридного белка проводят последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок — 1:(500-1000), а выделение — кристаллизацией в присутствии солей цинка.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования количество вводимой глюкозы регулируют по уровню растворенного кислорода и рН.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию гибридного белка проводят в 5-10-кратном объеме глицин-NaOH буфера, рН 9-11.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дитиотреитол добавляют до конечной концентрации 5-10 мМ.
Источник
