Способ получения мезенхимальных стволовых клеток
ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ
Развивающимся направлением клеточной медицины является использование уникальных свойств прогениторных клеток, обладающих высокой биологической активностью и потенциалом дифференцировки. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) являются полипотентными клетками, обладающими рядом важных для клинического применения свойств. Применение ММСК, культивированных «ex vivo», открывает вопрос об оценке качества и безопасности культуры для клинического применения. Целью настоящего обзора являлась разработка программы культивирования и исследования значимых свойств человеческих ММСК для клинического применения. Приведена характеристика этапов оценки качества и безопасности ММСК, включая культивирование клеток «ex vivo», оценку иммунофенотипа, ростовых, иммуномодулирующих, регенеративных и прогениторных свойств, оценку генетической и микробиологической безопасности. Проведена оценка «in vitro» тестов для определения качества и безопасности ММСК. Подчёркивается, что выраженность свойств каждого отдельного образца различна и зависит от источника и условий культивирования клеток.
Внедрение клеточных технологий в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины. Использование уникальных свойств прогениторных клеток, обладающих высокой биологической активностью и потенциалом дифференцировки является развивающимся направлением клеточной медицины. В настоящее время считается, что теория стволовой клетки, выдвинутая в начале прошлого века А.А. Максимовым в отношении клеток-предшественниц гемопоэза, в полной мере оправдалась в виде открытия этих и других полипотентных стволовых клеток. Один из типов полипотентных клеток – мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) – был открыт в 70-х гг. прошлого века [1] . В многочисленных экспериментальных исследованиях доказана их способность к остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцировке, что к настоящему времени является одним из облигатных критериев ММСК. Кроме того, по ряду данных, они способны к дифференцировке в кардиомиоциты, клетки скелетной, мышечной и нервной тканей [2] .
Остаётся открытым вопрос об оценке качества и безопасности ММСК, культивируемых для клинического применения. Очевидно, что каждый образец ММСК, который будет применён для лечения, должен быть оценен с позиции наличия у клеток необходимых в данной клинической ситуации полезных биологических свойств и безопасности для пациента.
Известно, что различные образцы ММСК, даже выделенные из близких по происхождению тканей, могут обладать разным потенциалом для клинического применения [3] . Становится очевидным, что при культивировании ММСК «ex vivo» необходимо проведение ряда исследований, касающихся оценки свойств полученных клеток. Во-первых, нужно оценить безопасность образцов ММСК. Во-вторых, подтвердить, что полученные в ходе культивирования клетки действительно относятся к ММСК. В-третьих, провести оценку терапевтического потенциала полученных клеток с позиции регенеративных, иммуномодулирующих свойств и способности создавать микроокружение для клеток, входящих в гемопоэтический ряд (рис.).
Целью настоящего обзора литературы являлось определение основных этапов исследований индивидуальных значимых свойств образцов человеческих ММСК в процессе культивирования для клинического применения.
Источники получения ММСК
Доступные для клинического применения тканевые источники ММСК принято делить на взрослые и неонатальные [4] . К первым относят костный мозг (КМ) [5] , периферическую кровь [6] , жировую ткань [7] , также имеются сообщения об экспансии ММСК из лёгочной ткани и сердца [8, 9] , фактически ММСК выделяются из всех источников, имеющих соединительнотканный компонент, порой эти источники весьма экзотичны [10] .
К неонатальным источникам ММСК относят пуповинную кровь, амниотическую жидкость, плаценту, плодные оболочки, пупочный канатик, Вартонов студень [4] .
Существенным преимуществом неонатальных тканей является их доступность, относительно неинвазивное получение. Кроме того, предполагается, что ММСК из неонатальных тканей могут обладать дополнительными свойствами по сравнению с ММСК взрослых тканевых источников такими, как большие пролиферативный потенциал, продолжительность жизни и дифференцировочные потенции [11, 12] . Например, ММСК из плаценты человека (ММСКпл) имеют больший пролиферативный потенциал и способность к приживлению, по сравнению с костномозговыми «аналогами» (ММСКкм) [13–15] . Следует отметить, что плацента состоит из клеток матери и плода, следовательно, требуется индивидуальная оценка функций каждого образца клеток.
Правило, согласно которому пролиферативный потенциал ММСК обратно пропорционален возрасту донора клеток, особенно актуально для взрослых тканевых источников [16] . То есть предпочтение в случае необходимости использования аллогенных ММСК следует отдавать материалу, полученному от молодых людей.
Очевидно, что эксплантация источников ММСК взрослого организма (костный мозг, жировая ткань) требуют инвазивного вмешательства, чреватого осложнениями. Неонатальные же источники ММСК могут быть получены без какого-либо значимого вмешательства в процесс родов.
Таким образом, контроль качества материала для экспансии ММСК должен включать комплекс медицинских, этических и правовых мероприятий, связанных с забором материала для экспансии, особенно связанного с инвазивными процедурами. Важен возраст донора в случае культивирования ММСК из взрослых тканей, в случае забора плацентарной ткани требуется оценка доли клеток фетального происхождения и доли материнских ММСК.
Условия культивирования ММСК
Впервые процесс культивирования ММСК на примере популяции костномозгового происхождения описал А.Я. Фриденштейн [1] . Классический метод культивирования ММСК заключается в инкубировании адгезионной культуры клеток в MEM средах с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).
Содержание ЭТС в среде для культивирования ММСК варьирует у разных исследователей от 2 до 20%. При этом выявлено, что процентное содержание сыворотки в среде влияет на иммуномодулирующие свойства полученных клеток [15] .
В качестве альтернативы ЭТС предлагают использовать человеческую сыворотку, тромбинактивированный человеческий тромбоцитарный релизат и человеческий тромболизат [17, 18] . По данным нескольких авторов, человеческий тромболизат, лишённый ксеногенности, по сравнению с ЭТС, обладает лучшими ростовыми характеристиками [17, 19–21] .
Тем не менее, как ЭТС, так и тромболизат являются компонентами биологического происхождения, точный состав которых не поддаётся стандартизации. Состав ЭТС и тромболизата, а следовательно, их ростовые характеристики, меняются от серии к серии и, как следствие, изменяются условия культивирования ММСК [21] .
Отмечено, что физиологические условия для ММСК включают существенно сниженное по сравнению с внешней средой содержание кислорода (1–7%). Предполагается, что культивирование ММСК в условиях гипоксии приводит к активации HIF-1-зависимых механизмов, влияющих на рост и дифференцировку клеток. Гипоксия также вызывает увеличение экспрессии факторов адгезии и миграции ММСК [22] , приводит к повышению проангиогенного потенциала за счёт увеличения экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), что важно для применения ММСК в лечении пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями [23] . Имеются также данные, что культивирование в условиях гипоксии способно поддерживать хорошее качество культур ММСК, полученных из материала доноров возрастом вплоть до 58 лет [24] .
Таким образом, различные условия культивирования ММСК существенно влияют на их свойства. Следовательно, изменяя условия культивирования образцов ММСК можно добиться улучшения их клинически значимых характеристик.
Оценка «чистоты» полученной культуры ММСК
При экспансии in vitro происходит элиминация клеток, неспособных к адгезии к поверхности культурального пластика, что в итоге приводит к отчистке культуры от большинства посторонних клеток [25] . Считается, что чистая культура ММСК может быть получена на 2–3 пассаже [26] . Это особенно актуально для быстрорастущих культур из неонатальных тканей, требующих подтверждения принадлежности популяции клеток к ММСК. Для этих целей используются иммунофенотипирование и определение способности к основным направлениям дифференцировки – хондро-, адипо- и остеогенной [27] .
При изучении свойств ММСК было обнаружено большое количество поверхностных кластеров дифференцировки, экспрессируемых клетками. Если взять все описанные для ММСК маркеры, использующиеся для идентификации или селекции ММСК, то их число превысит несколько десятков. Данные по экспрессии поверхностных маркеров ММСК представлены в таблице.
По данным разных авторов, существуют отличия в иммунофенотипе ММСК, выделенных из разных источников и при разных условиях культивирования. Например, CD271 экспрессируется на поверхности ММСКкм, и не определяется у ММСКпл [52] , различаются данные по продукции STRO-1 [49, 51] , сильно варьируют данные по экспрессии CD105 и особенно CD106 в зависимости от источника ММСК [53, 51] .
В целях стандартизации, Международным обществом по клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy) были предложены минимальные критерии идентификации человеческих ММСК: адгезия к поверхности культурального пластика, экспрессия CD105; CD73 и CD90 в сочетании с отсутствием CD45/CD34, CD14 или CD11b, CD79α или CD19/HLA-DR, а также способность к дифференцировке в трех ортодоксальных направлениях – остео-, хондро- и адипогенном [52] .
Оценка способности ММСК к дифференцировке
Способность ММСК к адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировке не вызывает сомнений и, как уже было указано ранее, является неотъемлемым признаком ММСК [52, 54] . Дифференцировочный потенциал может быть определен при культивировании клеток в специальных условиях, с последующим выявлением специфических для того или иного направления дифференцировки изменений (морфологических, цитохимических, иммунологических и генетических).
Остеогенная дифференцировка ММСК предполагает способность данных клеток «развиваться» в остеобласты, что определяет перспективы применения ММСК для обеспечения репаративной регенерации костной ткани [55] , в том числе для лечения несовершенного остеогенеза [56] . Для индукции остеогенной дифференцировки ММСК в культуральную среду добавляют дексаметазон, аскорбиновую кислоту и β-глицерофосфат [26] . Дифференцировка ММСК в остеобласты подтверждается экспрессией щелочной фосфатазы, наличием внеклеточных преципитатов солей кальция [57] .
Показано, что остеогенный потенциал ММСК, полученных из разных тканевых источников, отличается. В частности, показаны более выраженные остеогенные свойства ММСК пуповины, по сравнению с ММСКкм [58] . В целом, отмечается, что способность к дифференцировке напрямую зависит от уровня пролиферативной активности клеток [55, 58] . Исследование P. Janickietal et al. (2011) показало, что ММСКкм разных доноров обладают различным остеогенным потенциалом [55] . Оценка остеогенных потенций осуществлялась методом определения щелочной фосфатазы в клеточном лизате культуры ММСК на 7, 14 и 21 день остеогенной индукции. Выявлена прямая связь уровня щелочной фосфатазы клеточного лизата со способностью формировать кость in vivo. Было показано, что способность ММСК к остеогенной дифференцировке характеризуется высокой экспрессией генов CDC20, Runx2, ростом уровня трансформирующего фактора роста-β (TGFβ), интерлейкина 11 (ИЛ11) и низкой экспрессией гена HIST2H2AA3 [55. 59. 60] .
Хондрогенная дифференцировка ММСК открывает перспективы клинического применения клеток с целью восстановления хрящевой ткани, прежде всего суставных хрящей. Хондрогенную дифференцировку ММСК индуцируют in vitro, добавляя в культуральную среду основной фактор роста фибробластов (bFGF) и TGFβ3 [57] или костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) [61] . Процессы хондрогенеза in vitro могут быть подтверждены окрашиванием Сафранином О или алцианом синим [62] , определением глюкозоаминогликанов – основного компонента аморфного вещества хрящевого межклеточного матрикса [63] . Мониторинг хондрогенеза в культуре проводится по уровню экспрессии генов: агрекана (Aggrecan), фактора транскрипции Sox9 и коллагена второго типа (Col2a1) [61, 61] методами количественной ПЦР или иммуногистохимией. Следует учитывать, что хондрогенная дифференцировка сопровождается экспрессией HLA-DR [64] .
В качестве критерия оценки хондрогенного потенциала ММСК может быть использовано определение специфических микро РНК (miR-140) и уровня экспрессии регулируемых mRNA генов Sox9 и Col2a1 [62] .
Кардиомиогенная дифференцировка ММСК открывает перспективы использования клеток в регенеративной терапии сердечно-сосудистых заболеваний [65] . По результатам последних экспериментальноклинических данных, положительный эффект ММСК на течение сердечно-сосудистых заболеваний связан с их паракринным действием – продукцией цитокинов и регуляторных miRNA, способствующих устойчивости кардиомиоцитов к гипоксии и апоптозу [66, 67] . Дифференцировка ММСК в кардиомиоциты in vitro достигается путём обработки культуры 5-азоцитидином. Морфологическим критерием прошедшей дифференцировки является наличие в культуре спонтанно сокращающихся «валиков» кардиомиоцитов. Клетки экспрессируют гены GATA4, Nkx2,5, коннексин 43, тропонины T и I, кардиотрофин I [68] . Была выявлена экспрессия клетками предсердного и мозгового натрий-уритического пептидов (ANP и BNP) [68] .
Нейроноподобная дифференцировка ММСК представляет интерес для лечения нейродегенеративных заболеваний и реабилитации больных с острыми и хроническими нарушениями кровообращения головного мозга [69, 70] .
Дифференцировка ММСК в нейроноподобные клетки достигается путём культивирования с эпидермальным фактором роста (EGF), фактором роста гепатоцитов (HGF), VEGF. Другим набором индукторов для нейроноподобной дифференцировки является смесь бутилат гидроксианизола (BHA), хлорида калия, вальпроевой кислоты, форсколина, гидрокортизона и инсулина [71] . Следует отметить, что существует мнение о том, что ММСК проходят только глиальную дифференцировку, что может отражать их роль в эмбриогенезе как предшественников глиальных клеток [72] .
Морфологически нейроноподобные клетки, полученные из ММСК, выглядят как пирамидальные клетки с отростками [71] . Биохимическими маркерами нейроноподобных клеток являются: нейронспецифическая енолаза (NSE), кислый протеин глиальных фирилл (GFAP), микротубулярные белки 2 (Map2), галактоцереброзид (Gal C), астроцитспецифический белок S100-p [71, 73] . Маркерами ранней нейроноподобной дифференцировки является экспрессия генов GFAP, NSE, Map2, NF-M, GAP-43, Gal C [71, 74] .
Способность к нейроноподобной дифференцировке несколько отличается у ММСК, выделенных из разных тканевых источников. Отмечено, что при дифференцировке ММСКкм и ММСК пуповины экспрессируют ранние нейронные маркеры (нестин, musashi12 и A2B5) и дофамин-специфические маркеры (тирозингидроксилаза (TH) и белки связанные с ядерными рецепторами-1 (Nurr1)), но отличаются по продукции зрелых нейрональных белков (β-тубулин III и Map2ab) [74] .
Печеночноклеточная дифференцировка ММСК. Обнаружено, что ММСК как неонатальные, так и полученные из взрослых источников способны дифференцироваться в гепатоцит-подобные клетки [75] . Исследуется возможность использования ММСК для гистотипического восстановления ткани печени [76, 77] . Существуют данные, что ММСК за счёт паракринного эффекта улучшают трофику гепатоцитов и снижают уровень апоптоза [78] . In vitro ММСК дифференцируются в гепатоцитоподобные клетки при обработке HGF, онкостатином М, никотинамидом, bFGF, трансферрином [79] .
Признаками печеночноклеточной дифференцировки ММСК являются: продукция альбумина, накопление гликогена, секреция мочевины, поглощение липопротеинов низкой плотности и индуцируемая фенобарбиталом активность цитохрома p450 [79, 80] . Также наблюдается экспрессия цитокератинов 19 и 20 (CK19, CK20), тубулина, мРНК генов FEM1B, PSMC2, дисульфид-изомеразы А3 (DPIA3) и GAPDH [79] .
Дифференцировка в клетки островков поджелудочной железы. Способность дифференцироваться в клетки островков поджелудочной железы [81, 82] открывает перспективы использования ММСК в лечении пациентов с сахарным диабетом. Впрочем, возможен терапевтический эффект от трансплантации ММСК при аутоиммунном диабете I типа вследствие их иммуномодулирующих свойств [83] . Были описаны методы получения инсулинпродуцирующих клеток (ИПК) из ММСК в специальной индуцирующей среде, содержащей высокий уровень глюкозы (25 ммоль/л), никотинамид, активин А, β-целлюлин [84] . ИПК были получены из ММСК разных источников: как взрослых [81, 82] , так и неонатальных [85, 86] тканей человека.
ИПК идентифицируются по экспрессии следующих генов: инсулин I и II, GLUT2, глюкозокиназа, островковый амилоидный полипептид (isletamyloidpolypeptide), нестин, pancreaticduodenalhomoeobox 1 (PDX1), Pax6, а также по способности синтезировать С-пептид и инсулин [84] .
Проведённые пилотные клинические исследования терапии сахарного диабета II типа показали, что трансплантация ММСК при данной патологии – «простой, безопасный и эффективный терапевтический метод» [87] .
Таким образом, оценка дифференцировочного потенциала ММСК проводится в двух направлениях:
1) качественное, цель которого подтвердить способность данной культуры к дифференцировке;
2) количественное, с целью оценить клиническую ценность данного конкретного образца.
Однако, терапевтический эффект клеток проявляется, зачастую, за счёт обеспечения и улучшения выживаемости клеток реципиента, то есть благодаря паракринному действию ММСК, а не их непосредственной дифференцировкой в целевой тип клеток. Следует учитывать, что по мере дифференцировки аллогенные ММСК становятся иммуногенными и, в случае несовместимости по HLA, отторгаются [88, 89] .
Определение пролиферативного потенциала ММСК и старения клеток в культуре
Как уже упоминалось, образцы ММСК, полученные из разных источников, а также от разных доноров отличаются по пролиферативной активности [11–14, 16, 90] , которая тесно связана со старением клеток в культуре и, как следствие, старением и апоптозом in vivo. Выявлено, что старение ММСК in vivo коррелирует со старением клеток in vitro [91] , что подтверждает более высокий пролиферативный потенциал неонатальных ММСК по сравнению с клетками взрослых доноров.
Пролиферативную активность клеток можно определить по культуральным свойствам. Метод определения максимально возможного количества пассажей плохо воспроизводим, так как в различных лабораториях варьируют условия культивирования [92, 93] . Более точными являются методы определения кратности прироста клеток в процессе экспансии, метод определения скорости удвоения популяции клеток [18, 94] . Также достаточно точным является метод определения колониеобразующей активности ММСК [95] .
Отмечено, что ММСКкм на поздних пассажах экспрессируют на своей поверхности рецептор к лептину (CD295) [96] , который принято считать маркером старения клеток. Уровень пролиферации может определяться количественно МТТ тестом, основанным на способности клеток восстанавливать 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразола бромид (МТТ) с изменением интенсивности окраски [97] . Применяется и метод определения активности ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-gal) [98] .
Показано, что в процессе культивирования ММСК с каждым следующим пассажем проявляются постепенно нарастающие изменения глобального профиля экспрессии генов. Этот вывод был сделан W. Wagner с соавт. (2008), которые проанализировали глобальный профиль экспрессии генов культуры ММСКкм от 2 до 11 пассажа [91] . При старении ММСК отмечается увеличение экспрессии таких генов, как PARG1, CDKN2B, andp16ink4a и снижение экспрессии MCM3, PTN, Bmi-1 [94, 99-101] .
Важную роль для оценки пролиферативного потенциала и старения клеток придают определению длины теломер и активности теломеразы [102– 104] . Отмечается, что уровень теломеразы взрослых ММСК низкий, однако скорость укорочения теломер ниже, чем у специализированных клеток, таки как хондроциты [105] .
Стоит отметить, что обычно при нормальном старении наблюдается обратная тенденция изменения экспрессии таких генов, как с-Myc, p16, p53 и теломеразы по сравнению с туморогенным перерождением ММСК [95] .
Взаимодействие ММСК с другими клетками
Важнейшим свойством ММСК, которое является основой большинства случаев их клинического применения, является способность взаимодействовать с другими клетками как in vitro, так и in vivo. Взаимодействие с другими клетками реализуется как за счет непосредственных клеточных контактов, так и посредством продукции паракринных факторов. Виды взаимодействия ММСК с другими клетками организма, определяющие клинический эффект, можно подразделить на:
– взаимодействие ММСК с клетками иммунной системы (иммуномодулирующий и противовоспалительный эффект);
– взаимодействие с клетками повреждённых тканей (трофический и антиапоптотический эффект);
– стимуляция ангиогенеза (улучшение васкуляризации тканей);
– формирование стромы для гемопоэтических предшественников (обеспечение гемопоэза).
Взаимодействие с клетками иммунной системы. Известно, что ММСК могут модулировать активность иммунокомпетентных клеток in vitro. Это касается ингибирующего эффекта ММСК на Т-клеточную пролиферацию и дифференцировку дендритных клеток, которые считаются ключевыми звеньями активации аутоиммунных заболеваний и реакции трансплантант против хозяина (РТПХ) [83] .
В связи с тем, что ММСК не экспрессируют антигены MHC II, было высказано предположение об их «иммунной привилегированности» [106] . Однако было выяснено, что данное свойство клеток является нестабильным, теряется при дифференцировке клеток [88, 89] .
В настоящее время принято считать, что аллогенные ММСК не являются иммунопривилегированными клетками и принцип их действия на иммунную систему организма описывается как «дотронулся и ушёл» («touch and go») [107] . Влияние ММСК на иммунную систему достигается как непосредственным контактом с иммунокомпетентными клетками, что может быть оценено in vitro при совместном культивировании, так и посредством паракринной функции с выделением цитокинов.
ММСК дозозависимо снижают Т-клеточную пролиферацию (СD8 и CD4 клетки – как клетки памяти, так и наивные) [108] как контактно, так и с помощью растворимых факторов – TGFβ, простагландина Е2 (PGE2), индоламин 2,3-дезоксигеназы (IDO), HGF, ИЛ10, HLA-G, NO [109, 110] . Кроме того, ММСК индуцируют пролиферацию CD8+/CD25+/ foxp+/Treg клеток [111] . Отмечено, что одним из механизмов иммуносупрессии Т-лимфоцитов ММСКкм и ММСКпл является экспрессия генов B7H4 и PDL1 [112] .
ММСК снижают пролиферацию и цитотоксическую активность NK клеток контактным способом, а также с помощью факторов PGE2, TGFβ, IDO и путём снижения продукции интерферона-γ (IF-γ) [83] . ММСК снижают уровень пролиферации и дифференцировки B-клеток, останавливая их клеточный цикл, модулируют продукцию антител, хемокинов CXCR4/CXCL12, CXCR5/CXCL13 за счёт действия растворимых факторов [113] .
Цитокины, выделяемые ММСК – ИЛ6, PGE2, макрофагальный колоние-стимулирующий фактор (M-CSF) – ингибируют дифференцировку и созревание дендритных клеток (главным образом DCI типа) из моноцитов 115 , что приводит к снижению экспрессии ими клеточных маркеров CD11c, CD83, синтеза TNF α, IF-γ, ИЛ12 и остановке клеточного цикла на стадии G0/G1.
В последнее время важную роль придают активации разных типов TLR – рецепторов ММСК, позволяющих разделить популяцию клеток на два типа по иммуномодулирующей активности: ММСК-1 – провоспалительные; МСК-2 – иммуносупрессивные [117] , что в совокупности позволяет определить общий эффект ММСК на иммунную систему термином «иммуномодулирующий».
Взаимодействие ММСК с клетками повреждённых тканей. В настоящее время считается, что регенераторный потенциал ММСК в большей части обусловлен их способностью к протекторному и трофическому действию на ткани в области повреждения [118–120] . Под протекторным и трофическим действием ММСК мы объединили такие эффекты, обусловленные гуморальным и контактным взаимодействием с другими клетками, как стимуляция ангиогенеза [120] , снижение уровня апоптоза клеток повреждённой ткани и трофическое действие на клетки [121] .
Известно, что положительный эффект воздействия ММСК на дегенеративные заболевания нервной системы объясняют экспрессией нейротрофических факторов, таких как b-NGF, NT-3, NT-4, BDNF нейрорегулин-1, а также IGF-1 и VEGF [183, 184] . Известно, что ММСК экспрессируют большое количество цитокинов (М-КСФ, ИЛ6, ИЛ11, ИЛ15, SCF, VEGF и др.) [122] , причём их экспрессия увеличивается при культивировании в условиях гипоксии [123] . При использовании таких методов, как количественное определение уровня цитокинов в среде с ММСК, а также стимуляция in vitro макрофагов и эндотелиальных клеток было показано, что паракринная функция ММСК выше, чем у фибробластов кожи [123] . Отмечаются некоторые отличия в экспрессии цитокинов ММСК из различных источников, таких как продукция SDF-1 ММСКкм и экспрессия sICAM-1 ММСКпл [124] .
В силу многофункциональности, интерлейкины также принимают участие в ангиогенезе и регуляции метаболизма клеток. Отмечается экспрессия ММСК таких факторов роста, как TGF-β, VEGF, HGF, b-NGF, FGF, IGF [125] . Все эти факторы являются анаболическими стимуляторами клеток и проангиогенными факторами, а с ростом сосудов микроциркуляторного русла восстанавливается снабжение кислородом и питательными веществами повреждённых тканей. Кроме того, протективный механизм действия ММСК заключается в активации циклоксигеназы-2 (COX-2). Интерлейкины ИЛ6 и ИЛ8 также обладают проангиогенными свойствами [126] .
Формирование стромы для гемопоэтических предшественников и обеспечение гемопоэза. Очевидно, что одним из основных свойств ММСК является формирование стромального микроокружения красного костного мозга. Выявлено, что ММСК ускоряют и улучшают приживление трансплантированных ГСК. Действие ММСК реализуется через экспрессию цитокинов, регулирующих хоуминг, приживление (SDF1), пролиферацию и дифференцировку ГСК (ГМ-КСФ, Г-КСФ, SCF, ИЛ6, EPO) [123, 127] . Поддержка кроветворения ММСК подтверждается также при совместном культивировании ММСК и ГСК [128] .
Оценка генетической стабильности ММСК
Экспансия ММСК для получения дозы клеток, достаточной для клинического применения, проводится ex vivo, то есть в нефизиологических условиях. В связи с этим, весьма обоснованным является мнение, что в процессе культивирования может возникнуть генетическая нестабильность и мутации ММСК. Это предположение подтверждают результаты исследования генетической нестабильности мышиных и крысиных ММСК в культуре [10, 95] , в меньшей степени при исследовании человеческих ММСК с аналогичными выводами – культура клеток в результате длительного пассирования может приобрести туморогенный потенциал [125, 129] . Однако результаты других исследований свидетльствуют о том, что ММСК из разных источников – как взрослых, так и фетальных – редко трансформируются в потенциально опасные клетки [94, 130] . В связи с этим, важнейшей задачей является контроль генетической стабильности культивируемых ex vivo ММСК. Одним из методов, который позволяет выявить клетки с нестабильным геномом, является кариотипирование. Однако кариотипирование не может выявить дуплекации или делеции небольших участков хромосом [131] . По данным C.L. Louise с соавт. (2011), существенными являются нарушения в 12 хромосоме, касающиеся локусов, в которых расположены гены, ассоциированные с полипотентностью (NANOG и NANOGP1), и в 20 хромосоме – геныонкосупрессоры (BCL-2-L1) [132] . Однако авторы сделали вывод, что нарушения выражены в основном микроаберрациями, которые нельзя выявить с помощью обычных кариологических методов. Другой метод тестирования стабильности генома ММСК – сравнительная геномная гибридизация (array comparative genomic hybridization (CGH)). Он более чувствителен, однако не способен выявить сбалансированные транслокации или минорные мутации [131] .
Ряд авторов указывают, что одним из механизмов трансформации ММСК является нарушение функционирования генов-регуляторов клеточного цикла, таких как p14(Arf), p16INK4A, p21, p53, CDK-1, CDK-2, CDK-6, c-Myc, HGMA2, INK4A и RB [95, 129, 133] . Исследование уровня теломеразы (hTERT) и длины теломер также может помочь выявить трансформацию ММСК [134] . Исследование, проведенное B.G. Jeon c соавт. (2011) показало, что ММСК в сравнении с опухолевыми клетками линий MDA-MB231, U-87 MG и MCF-7 обладают большей длиной теломер, однако теломеразная активность опухолевых клеток достоверно выше [135] .
А.С. Григорян с соавт. (2009) отмечают, что единичные культуры ММСКкм при стандартных условиях культивирования подвержены трансформации даже на ранних пассажах [130] . Этот феномен встречается примерно в одной из двухсот культур ММСКкм здоровых доноров. На 2–3 пассажах меняются морфологические характеристики клеток: они увеличиваются в размерах, становятся более отростчатыми, в ядрах выявляется 1–2 крупных ядрышка. Часть клеток, напротив, округляется, открепляется от культурального пластика и переходит в суспензию, где продолжает активно делиться. С каждым пассажем меняется иммунофенотип клеток – снижается экспрессия CD90 от 100% на первых пассажах до 10–15% к десятому пассажу. При анализе кариотипа данных клеток было обнаружено, что от 5 до 23% клеток в культуре несут множественные количественные и структурные хромосомные аберрации. Q. Li с соавт. (2010) также отмечают снижение экспрессии CD90 культурой ММСКкм, трансформированных с помощью химического канцерогена, по сравнению с нормальными клетками [136] .
Актуальность контроля туморогенного потенциала донорских ММСК подтверждает гипотеза о том, что генетические аберрации на ранних стадиях дифференцировки ММСКкм в связи с транслокациями участков хромосом могут давать начало злокачественным опухолям как костей, так и мягких тканей [136] . Существуют данные о том, что ММСКкм могут вести себя, как опухолевые стволовые клетки некоторых сарком 137 , а in vitro способны давать начало как саркомам [129, 140] , так и карциномам [141, 142] .
Говоря о гипотезе происхождения сарком из ММСК, стоит упомянуть, что саркомы по типам генетических изменений делятся на две группы: первая группа характеризуется точечными мутациями и транслокациями [143] , что сопровождает начало канцерогенеза, ко второй группе относят саркомы с выраженной кариологической нестабильностью и множеством грубых поломок генома [144] .
Сообщается, что саркома Юинга, как и другие представители группы периферических примитивных нейроэктодермальных опухолей (PPNT), может происходить из ММСКкм, что связывается со способностью ММСК к дифференцировке в глиальные клетки [145] . В случае глиальной дифференцировки ММСК экспрессируют ряд нейрон-специфических маркеров, что также характерно для саркомы Юинга и других PPNT. В эксперименте на мышах установлено, что экспрессия EWS-FLI-1 гибридного белка, связанного с 85% случаев семейной саркомы Юинга, способна преобразовывать в саркома-подобные опухоли ММСКкм [146] .
Некоторые исследователи приводят данные о том, что ММСК являются опухолевыми стволовыми клетками для остеосарком [140] , то же можно сказать о лейомиосаркоме [147] , генез которой связывают с инактивацией гена Pten. Получены экспериментальные данные о перерождении эмбриональных фибробластов в липосаркому у трансгенных мышей [148] . Имеются данные о происхождении опухоли Вильмса из ММСК почечной ткани вследствие мутации гена CTNNB1 и активации Wnt-сигнального пути [149] . Исследование показало, что большинство клеточных линий опухоли Вильмса обладали стабильным кариотипом по крайней мере до 25 пассажа, а также сопровождались потерей гетерозиготности хромосомы 11p из-за митотической рекомбинации 11р11 [149] .
Исходя из данных литературы, можно сделать вывод, что оценка генетической стабильности ММСК является неотъемлемой частью системы контроля качества культивируемых ex vivo клеток. Однако литературные источники говорят, что большинство нарушений, выявляемых в трансформированных ММСК, проявляются на генном уровне и лишь в ходе опухолевой прогрессии начинают проявляться грубые поломки генома.
Следует добавить, что исследования генетической стабильности ММСК важны не только для реципиента ММСК, но и для донора. Вероятно, наличие генетических поломок в культуре ММСК является неблагоприятным прогностическим признаком в плане возможного возникновения онкологических заболеваний у донора в будущем.
Микробиологическая безопасность культуры ММСК
Не нуждается в комментариях то, что ММСК, полученные для клинического применения, должны быть безопасны в плане отсутствия контаминации микрофлорой. Бактериологическая безопасность образцов ММСК достигается путём соблюдения ряда правил и норм асептики и антисептики, касающихся всего процесса экспансии ММСК – от забора материала до выдачи готовой к применению культуры. Более интересным и неисследованным является вопрос о вирусологической безопасности ММСК, так как возможен перенос вирусов как вне клеток вследствие загрязнения материала, полученного от донора – носителя вируса, так и внутри самих ММСК при наличии тропизма вируса к клеткам.
Исследование D. Gibellini с соавт. (2011), подтвержденном другими исследователями, позволяет предположить, что вирус иммунодефицита человека 1 типа способен внедряться в геном ММСК и, таким образом, клетки могут быть резервуаром ВИЧ [150, 151] .
Исследования не подтвердили способность вируса гепатита B инфицировать ММСК, даже после печёночно-клеточной дифференцировки [152, 153] , однако отмечается, что ММСКкм больных гепатитом B обладают пониженной пролиферативной активностью, к тому же изначально контаминированный вирусом материал может быть источником заражения после экспансии ММСК.
Было показано, что ММСК могут являться резервуаром для парвовируса B19, способного заражать ГСК [154, 155] . Исследователи подчёркивают необходимость тестировать ММСК на парвовирус B19 [154] . Также ММСК экспрессируют на своей поверхности CD46 – рецептор к вирусу герпеса 6 типа, что делает возможным заражение ММСК вирусами герпеса 6 и 7 типов [155] . Возможно заражение ММСК вирусом варицелла зостер, цитомегаловирусом и вирусом простого герпеса 1 типа [155, 157] .
Существуют опасения, что благодаря иммуносупрессивным эффектам, ММСК могут подавлять механизмы антимикробной резистентности, повышая тем самым риск инфицирования [157] . Однако, по последним данным, этот эффект не характерен для ММСК человека, более того, человеческие клетки, благодаря экспрессии индоламин 2,3-диоксигеназы и цитокинов, стимулируют противомикробные механизмы защиты организма [158] .
Из приведённых данных следует вывод, что вирусологическое исследование образца ММСК должно включать как обследование самого донора, так и тестирование культуры ММСК на наличие в ней генома вирусов, тропных к ММСК.
Заключение
Таким образом, на основании анализа данных литературы можно привести основные этапы исследования клинически значимых свойств образцов ММСК. Контроль качества ММСК можно разделить на:
1. Общий контроль качества – безопасность полученных клеток и их общебиологических свойств, включающий:
а) оценку микробиологической безопасности:
– бактериологическое исследование среды, в которой культивировались клетки;
– серологическое исследование донорской сыворотки на антитела и антигены ВИЧ, гемотрансмиссивных гепатитов, парвовируса, цитомегаловируса, ВПГ1 и герпеса 6 типа;
– ПЦР исследование МСК с целью выявления вирусов: парвовирус, цитомегаловирус, ВПГ 1, герпес 6 типа;
б) иммунофенотипирование полученных ММСК – иммунологический минимум для подтверждения принадлежности к ММСК: определение экспрессии CD105, CD73 и CD90 в сочетании с отсутствием экспрессии CD45, CD34; CD14 или CD11b; CD79α или CD19 и HLA-DR;
в) оценка пролиферативных свойств и темпа старения ММСК в культуре – определение кумулятивного времени удвоения популяции, определение относительного количества КОЕ-Ф, МТТ-тест, качественная или количественная оценка активности ассоциированной со старением β-галактозидазы, оценка длины теломер;
г) качественная оценка способности к дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлении – с целью подтверждения принадлежности культуры к ММСК – культивирование в соответствующих дифференцировочных средах.
2. Специальный контроль качества – набор лабораторных тестов (в зависимости от поставленной конкретной клинической задачи):
а) оценка генетической стабильности включает:
– кариотипирование, выявление транслокаций и делеций участков 12, 20 и других хромосом, сравнительная геномная гибридизация (CGH);
– определение экспрессии генов p14, c-Myc, p21, p53, CDK-1, CDK-2, CDK-6, c-Myc, HGMA2, INK4A и RB;
– определение длины теломер и активности теломеразы;
б) количественная оценка способности к остеогенной и хондрогенной дифференцировке – с целью оценки активности образца ММСК в перспективе дальнейшего приживления in vivo и замещения дефектов целевых тканей. Остеогенная дифференцировка может быть определена по экспрессии генов CDC20, HIST2H2AA3, Runx2, ИЛ11, количественной оценке уровня щелочной фосфатазы, глюкозоаминогликанов. Хондрогенная дифференцировка может быть оценена по экспрессии генов агрекана Aggrecan, Sox9, Col2a1, можно дополнительно определять уровень miR-140;
в) оценка иммуномодулирующих свойств ММСК – способность подавлять в культуре пролиферацию NK клеток и Т-лимфоцитов, уровень экспрессии цитокинов TGFβ, ИЛ6, ИЛ10, ИЛ12, TNF-α, простагландина Е2, индоламин 2,3-дезоксигеназы, HGF;
г) оценка поддержки ГСК – определение уровня цитокинов SDF1, ГМ-КСФ, Г-КСФ, SCF, ИЛ6, EPO;
д) оценка паракринной функции – определение уровня цитокинов b-NGF, NT-3, NT-4, BDNF нейрорегулин-1, IGF-1, VEGF, М-КСФ, ИЛ6, ИЛ11, ИЛ15, SCF, SDF-1,sICAM-1, TGF-b, HGF, FGFIGF, имеющих помимо всего прочего нейротрофическое, ангиогенное и противоапоптотическое действие;
е) проведение HLA-типирования в случае, если клинический эффект предполагает приживление и дифференцировку аллогенных ММСК.
Указанный перечень, сформулированный нами на основе анализа значительного объема экспериментально-клинических данных, является обобщенным – для каждой конкретной ситуации, в зависимости от цели клинического применения культуры ММСК из приведенного списка должны быть выполнены отдельные, наиболее значимые пункты.
Источник
