Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека («РосНИПЧИ «Микроб») (RU)
Приоритеты:
Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины. Изобретение представляет собой способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины, характеризующийся тем, что туляремийный микроб выращивают при температуре 37°C в течение 20±2 часов на питательной среде, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости. Изобретение направлено на получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины. 1 пр.
Формула изобретения
Способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины, характеризующийся тем, что туляремийный микроб выращивают при температуре 37°C в течение 20±2 часов на питательной среде pH 7,2, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к технологии производства медицинских иммунобиологических препаратов и может быть использовано в практике производства туляремийной живой вакцины.
В настоящее время иммунизация является самым надежным способом профилактики туляремии. В 2011 году в Российской Федерации против туляремии вакцинировано 317953 человека и ревакцинировано 1294433 человека (О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2011 году: Государственный доклад. — М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012. — 316 с.).
Туляремийная живая сухая вакцина в 2011 году Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ ( № 51н от 31 января 2011 г.) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации для населения, проживающего на энзоотичных по туляремии территориях, а также прибывших на эти территории лиц, выполняющих ряд работ.
Основным компонентом вакцины туляремийной живой сухой являются клетки туляремийного микроба вакцинного штамма 15 НИИЭГ.
Известен способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии (Патент на изобретение № 2221591, МПК A61K 39/40, 20.01.2004 г.), в соответствии с которым вирулентные и вакцинные штаммы Francisella tularensis выращивают в жидкой питательной среде, с последующей инактивацией биомассы фенолом в концентрации 0,5-2% и отделением низкомолекулярных примесей. Клетки отделяли путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 минут, затем ресуспендировали в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе и подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе при 0°C. Дезинтеграт клеток центрифугировали при 12000 g в течение 30 минут, полученный супернатант — при 100000 g. После удаления супернатанта осадок препарата для активной иммунизации ресуспендировали в деионизованной воде и трижды переосаждали путем центрифугирования при 100000 g с последующим ресуспендированием в деионизованной воде. Очищенный препарат лиофилизовали. Способ предназначен для получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Препарат, полученный по данному способу, обеспечивает защиту высокочувствительных животных при заражении высоковирулентными штаммами F. tularensis как при парентеральном, так и при пероральном способе иммунизации. Однако в связи с тем, что для получения целевого продукта клетки подвергают лизису фенолом и разрушают ультразвуковым воздействием, то описанный способ не пригоден для получения живой туляремийной вакцины.
Известен способ получения биомассы туляремийного микроба (Патент на изобретение № 2451743, МПК C12N 1/20, 27.05.2012 г.), согласно которому предварительно подготовленный посевной материал туляремийного микроба культивируют при pH 6,8-7,0, температуре 37°C в течение 18±2 ч на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: панкреатический гидролизат рыбокостной муки 20,5, стимулятор роста гемофильных организмов 5, экстракт пекарских дрожжей 2,3, сульфат магния 1,0, сульфит натрия 0,7, дигидрофосфат калия 1, цистеин 0,5. При культивировании туляремийного микроба в среду добавляют глюкозовитаминную добавку в количестве 2 мл на 100 мл среды (1,23 г/л). Затем культуральную жидкость освобождают от клеточной массы центрифугированием при 9000 об/мин в течение 20 мин или на сепараторе АСГ-3М при том же режиме. С полученного концентрата клеток получают антигены гидродинамическим смывом с последующим поэтапным осаждением с постепенным понижением pH (от 7,0 до 4,3) для освобождения от балластных веществ. На последнем этапе переосаждение повторяют 2-3 раза для окончательной очистки препарата. Технология позволяет получать большие объемы (для производственных целей) биомассы туляремийного микроба. Однако этапы отделения клеточной массы (получения клеточного концентрата) направлены на разрушение клеток. Концентрат, полученный по данному способу, пригоден для получения антигенных компонентов при создании диагностических препаратов против возбудителя туляремии и не может использоваться в качестве промежуточного компонента для дальнейшего приготовления живой туляремийной вакцины.
Кроме того, технология получения концентрата микробных клеток, получаемого по данному способу, не предусматривает асептического ведения процесса, что может привести к контаминации посторонней микрофлорой и, следовательно, выбраковке данного полупродукта для получения туляремийной живой вакцины, так как одним из требований является отсутствие посторонней микрофоры в культуре туляремийного микроба на всех технологических этапах приготовления живой вакцины.
Техническим результатом является получение концентрата микробных клеток туляремийного микроба, пригодного для получения живой туляремийной вакцины.
Технический результат достигается тем, что туляремийный микроб выращивают методом глубинного культивирования при температуре 37°C в течение 20±2 часов на жидкой питательной среде pH 7,2, содержащей, г/л: сухой ферментативный гидролизат фибрина, приготовленный из отхода сывороточно-вакцинного производства 50-55, глюкозу 10, пантотенат кальция 0,05, с последующим концентрированием микробной массы путем микрофильтрации культуры туляремийного микроба через мембраны с размером пор 0,2 мкм в режиме тангенциального потока жидкости.
Для достижения технического результата разработана жидкая питательная среда, подобран режим выращивания туляремийного микроба и подобраны характеристики пористых мембран, обеспечивающих процесс концентрирования туляремийного микроба.
Возможность использования микрофильтрационного концентрирования микробных клеток туляремии установлена нами экспериментальным путем и неизвестна из доступных источников информации.
Фильтрация в проточном (тангенциальном) потоке является разделительным методом, в котором поток жидкости направляется вдоль мембраны, омывая ее поверхность. Такой смывающий эффект позволяет постоянно удалять отложения, предотвращая их скапливание и образование слоя на поверхности фильтра, которое известно под названием концентрационной поляризации, уменьшающей скорость фильтрации. Материал, меньше номинального размера пор микрофильтрационной мембраны, проходит через нее в линию фильтрата. Материал, превышающей размера пор микрофильтрационной мембраны, «отбрасывается» мембранной и концентрируется в отдельную емкость. Потери продукта за счет незначительного «мертвого» объема мембраны минимальны и сводятся к нулю путем промывки мембранного модуля жидкостью в количестве, соответствующем «мертвому» объему мембраны.
концентрирование и очистка происходят без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений;
перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям;
механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно;
легко обеспечивается герметичность и асептические условия;
аппаратурное оформление просто по конструкции, компактно, отсутствуют движущиеся детали;
процесс не обладает высокой энергоемкостью.
Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.
Пример. Получение концентрата микробных клеток.
Для выращивания туляремийного микроба подготовили питательную среду с основой из ферментативного гидролизата фибрина. Для этих целей бульон варят в реакторе: под вакуумом закачивают воду очищенную (дистиллированную воду) согласно расчета, прибавляя 10% на ее выкипание, добавляют 50-55 г/л сухого ферментативного гидролизата фибрина в количестве, обеспечивающем содержание в среде не менее 0,32% аминного азота. Затем вносят глюкозу до концентрации 1%. Все перемешивают и устанавливают в среде pH (7,2±0,2) при помощи 20% раствора натрия гидроокиси и кипятят в течение 30 мин. Бульон фильтруют через фильтр Сальникова при температуре (75±5)°C под давлением (2,5±0,5) МПа. Жидкую среду из ферментативного гидролизата фибрина стерилизуют в паровом стерилизаторе водяным насыщенным паром при (110+2)°C в течение 30 мин, давлении (0,05+0,02) МПа. Перед внесением инокулята посевной культуры в стерильную среду добавляют стерильный раствор пантотената кальция в концентрации 0,005% (0,05 г/л). Приготовление жидкого ферментативного гидролизата фибрина приведено в патенте RU 2425866. Для получения в сухой форме ферментативный гидролизат фибрина концентрировали в 6-7 раз методом выпаривания на установке вакуум-выпарной УВВ-50 и высушивали конвекционным способом на сушильной установке распылительного типа КЯУЛ 101325.002 в «псевдокипящем слое».
Культуру F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ выращивают методом глубинного культивирования на подготовленной жидкой питательной среде при температуре 37°C в течение 20±2 ч часов. После окончания процесса культивирования нативная культура F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ имеет следующие характеристики: pH 7,0±0,1, концентрация микробных клеток 35±0,5 млрд. кл. мл -1 (по отраслевому стандартному образцу мутности — ОСО мутности 42-28-85-П (10 ME) ФГБУ НЦЭСМП Минздравсоцразвития России, эквивалентной концентрации 5 млрд. кл. мл -1 ), коэффициент жизнеспособности — 62±0,5%, посторонняя микрофлора отсутствует. Далее полученную микробную суспензию F. tularensis подвергают тангенциальной микрофильтрации на ультра-микрофильтрационной установке «Вива-флоу» через мембраны с размером пор 0,2 мкм до сокращения объема микробного осадка в четыре раза. При необходимости добавляют в концентрат стерильный физиологический раствор до восстановления исходного объема нативной культуры и процесс концентрирования повторяют. Полученный концентрат микробных клеток имел следующие характеристики: pH 7,2±0,1, концентрация микробных клеток 135±1,0 млрд. кл. мл -1 (по отраслевому стандарту мутности ФГБУ НЦЭСМП), коэффициент жизнеспособности — 60±0,1%, посторонняя микрофлора отсутствует. Контроль специфической стерильности фильтрата свидетельствовал об отсутствии в нем туляремийного микроба, что говорит о правильном подборе размера пор мембран.
В полученном концентрате не происходит ухудшения характеристик (в сравнении с нативной культурой F. tularensis вакцинного штамма 15 НИИЭГ после ее глубинного культивирования). В частности, pH и коэффициент жизнеспособности остаются на прежнем уровне и не происходит контаминации посторонней микрофлорой. Основываясь на этом, можно утверждать, что полученный концентрат пригоден для получения живой туляремийной вакцины.
Источник
Научная электронная библиотека
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Глава 9. ПРЕПАРАТЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРОТИВ ТУЛЯРЕМИИ
Возбудитель туляремии относится к роду Francisella, виду F. tularensis, группы 4 (Грамотрицательные, аэробные / микроаэрофильные палочки и кокки) определителя бактерий Берджи. Мелкие неподвижные палочковидные клетки. Облигатные аэробы. Спор не образуют. Грамотрицательны. Ферментативная активность туляремийного микроба не выражена. Возбудитель туляремии имеет Vi- и О-антигены. F. tularensis является внутриклеточным паразитом. Его вирулентность связана со способностью развиваться в фагоцитах и подавлять их киллерную активность, образовывать капсулу, эндотоксин, нейраминидазу. Антигены клеточной стенки обладают свойствами аллергенов, что ведет к сенсибилизации инфицированного организма и усугубляет действие других факторов вирулентности. Естественные хозяева возбудителя — грызуны, водные крысы, домовые мыши. Заражение людей происходит при прямом контакте с больными животными, их трупами, через объекты внешней среды и пищевые продукты, инфицированные выделениями больных грызунов. Возможен и трансмиссивный путь передачи через укусы кровососущих членистоногих. От больных людей заболевание не передается. Возбудитель может проникать в организм через слизистые оболочки верхних дыхательных путей, глаз, желудочно-кишечного тракта и даже через неповрежденную кожу. Это определяет разнообразие клинических форм инфекции: легочная, глазо-бубонная, абдоминальная, бубонная, язвенно-бубонная, генерализованная. Туляремия — особо опасная инфекция. Заболевание протекает тяжело, продолжается в среднем 4-6 недель и заканчивается, как правило, выздоровлением. Постинфекционный иммунитет характеризуется высокой напряженностью и определяется гуморальными и клеточными факторами. В первые недели или месяцы он нестерильный, а затем переходит в стерильный иммунитет. Для микробиологической диагностики используют методы серодиагностики, иммуноиндикации, постановку аллергической диагностической пробы с тулярином. В специализированных лабораториях проводят бактериологическое исследование (материал для исследования определяется клинической формой болезни). Культуру выделяют, заражая лабораторных животных. Для лечения туляремии используют антибиотики. Специфическая профилактика осуществляется живой туляремийной вакциной. Создана и химическая вакцина, приготовленная из протективного антигена. Туляремийная живая сухая накожная вакцина Вакцина представляет собой высушенную в условиях вакуума взвесь (в сахарозо-желатиновом растворе) культуры туляремийного вакцинного штамма, выращенной на искусственной питательной среде. Вакцинный штамм, полученный путем лабораторного ослабления (аттенуации) вирулентного штамма, обладает высокой иммуногенностью и безвреден для организма человека. Вакцину выпускают в запаянных стеклянных ампулах по 20 и более доз. Сухой препарат имеет вид беловатой таблетки, свободно перемещающейся в ампуле. К каждой ампуле сухой вакцины прилагается ампула со стерильной дистиллированной водой в объеме, необходимом для разведения вакцины. Разведенная вакцина имеет вид гомогенной взвеси. Вакцину применяют немедленно после разведения. Разведенной вакциной можно пользоваться не более 4 ч. Не использованную в указанный срок вакцину уничтожают кипячением или прибавлением к ней дезинфицирующего раствора. Прививку туляремийной вакциной проводят накожным (скарификационным) или внутрикожным (струевым) методом. Для этого используют одну и ту же вакцину, но в разных разведениях. Категорически запрещается вводить вакцину подкожно. Прививку накожным методом производят на наружной поверхности средней трети левого плеча. Предварительно кожу очищают спиртом или спиртом и эфиром. Когда спирт испарится, стерильной пипеткой наносят, не касаясь кожи, по одной капле разведенной вакцины в двух местах на расстоянии 3-4 см. Далее левой рукой обхватывают плечо с нижней его стороны и слегка натягивают сверху кожу, а правой — прививательным пером, которое перед каждой прививкой нужно кипятить или протирать спиртом и обжигать на пламени, производят на коже через каждую каплю вакцины по две параллельные насечки длиной до 1 см. насечки не должны быть чрезмерно глубокими или, наоборот, поверхностными. После скарификации вакцину втирают в насечки тупой стороной прививательного пера в течение 30 с. Затем дают вакцине высохнуть в течение 10-15 мин. В 1 мл вакцины содержится около 2-3 млрд. живых клеток (10 прививочных доз), а в двух каплях (одна прививочная доза) — не менее 200 млн. Число микробных клеток, попадающих в кожу при скарификации и последующем втирании, в точности не установлено, но, по-видимому, у взрослых составляет не менее 20 млн. Результаты вакцинации проверяют через 4-5 суток после прививки, а при отсутствии реакции в этот срок повторно проверяют через 12-15 суток. При наличии на коже по ходу насечек выраженной красноты и припухлости диаметром не менее 0,5 см результат прививки оценивают как положительный. Лицам, у которых прививочная реакция в указанные сроки не обнаружена, следует произвести повторную прививку в течение месяца после проверки. Вакцинация внутрикожным струйным методом осуществляется при помощи безыгольного инъектора. Сухую вакцину в ампуле, как и для накожной прививки, разводят дистиллированной водой в объеме, который указан на прилагаемой к вакцине ампуле с растворителем. Ампулу с разведенной вакциной тщательно встряхивают до получения гомогенной взвеси. Далее 1 мл этой взвеси набирают в стерильный шприц с длинной иглой и переносят во флакон, содержащий 19 мл стерильного физиологического раствора. Флакон встряхивают до получения равномерной взвеси. После разведения в 1 мл готовой для применения вакцины содержится 100-150 млн. живых бактерий. Разведенной вакциной можно пользоваться в течение 4 ч, после чего неиспользованную вакцину уничтожают кипячением или прибавлением к ней дезинфицирующих средств. Разведенную туляремийную вакцину вводят однократно внутрикожно в наружную поверхность средней трети левого плеча. Место инъекции предварительно обрабатывают спиртом. Непосредственно после инъекции на месте введения вакцины образуется папула диаметром до 1 мм, которая исчезает через 25-30 мин. У части привитых на месте введения вакцины отмечается незначительная болезненность, иногда выступает небольшая капля крови. Если на месте прививки папула не образовалась, что указывает на осечку инъектора, необходимо тут же повторить прививку на другом участке кожи плеча. Прививочная реакция развивается быстрее и несколько интенсивнее, чем при скарификационном методе, и, как правило, достигает максимума через 2 суток. Она характеризуется умеренно выраженной гиперемией и инфильтратом, обычно имеющими диаметр 1-4 см, редко больше. Гиперемия и отечность к 5-м суткам уменьшается и к 9-м суткам у первично вакцинированных исчезают. Корочка на месте прививки обычно не образуется. После прививки с положительным результатом развивается иммунитет, который через 15-20 дней достигает обычно уровня, обеспечивающего защиту при контакте с возбудителями инфекции. В случае правильно проведенной прививки полноценной вакциной кожная аллергическая реактивность обнаруживается через год после вакцинации у 98 % взрослых привитых. У части привитых в сыворотке крови к концу 1-й недели после вакцинации появляются антитела к антигену туляремийного микроба, выявляемые в реакции агглютинации. К исходу 5-7-й недели титр антител достигает максимума, а затем начинает снижаться. Ревакцинацию лиц, привитых против туляремии, проводят через 5 лет. Туляремийную вакцину следует хранить в сухом, темном помещении при температуре не выше 6 °С (можно при температуре ниже 0 °С). Чем ниже температура хранения, тем лучше сохраняется активность препарата. Срок годности вакцины — 1 год. По истечении срока годности вакцины можно произвести ее переконтроль. Если по количеству живых микроорганизмов вакцина отвечает требованиям, то срок годности может быть продлен на 6 мес. Тулярин для аллергической пробы Туляремийный диагностикум — тулярин — изготавливается из вакцинного штамма, обладающего всеми типичными свойствами. Маточная взвесь туляремийных микробов разводится 3 %-ным глицериновым физиологическим раствором до концентрации в 10 млрд. микробных тел в 1 мл по туляремийному стандарту и инактивируется однократным прогреванием при 70 °С в течение 1 часа. После прохождения контроля на стерильность препарат разливают в ампулы по 1 мл, запаивают и повторно прогревают при 70 °С 1 час. Готовый препарат представляет собой слегка желтоватую жидкость. Он должен быть гомогенным, содержать типичные для вакцинного штамма грамотрицательные туляремийные бактерии, быть стерильным, безвредным и биологически активным. Стерильность препарата проверяется обычным способом. Постановка накожной пробы с тулярином у людей воспроизводится так же, как и вакцинация. Местная реакция наступает через 24 часа и достигает максимума через 48-72 часа. Учет ее производится через 48 часов. Определяют размеры гиперемированного и отечного участка кожи вдоль и поперек насечек. Реакция считается положительной при величине реагирующего участка в 0,5 см и более. Исчезает она к 7-15 дню. На месте насечек к этому времени остается мало заметный след. Категорически запрещается этот препарат применять подкожно и внутрикожно. Срок годности препарата — 3 года. Помимо тулярина, предназначенного для накожного применения, изготавливается препарат, применяемый внутрикожно. Препарат отличается меньшим содержанием убитых микробов (500 млн. микробных тел в 1 мл). Он представляет собой взвесь убитых нагреванием туляремийных микробов в 3 % глицериновом физиологическом растворе. Готовый тулярин поверяется на чистоту, стерильность, специфическую безвредность и биологическую активность обычными способами. Биологическая активность испытывается на морских свинках белой масти весом 500 г, а специфическая безвредность — на белых мышах, которым вводят по 0,5 мл препарата. Тулярин для внутрикожного применения вводится в дозе 0,1 мл строго внутрикожно на внутренней поверхности предплечья. Учет реакции производят через 24-48 часов. В положительных случаях на месте введения препарата через 4-10 ч отмечается появление местной реакции; через сутки она выражена отчетливо и имеет вид гиперемированного болезненного отека или инфильтрата. Гиперемия без отека, исчезающая через сутки, рассматривается как отрицательная реакция. Внутрикожная проба после перенесенного заболевания остается положительной в течение нескольких лет. Тулярин, предназначенный для внутрикожной пробы, непригоден для накожного применения, так как он не вызывает диагностической реакции. Туляремийный эритроцитарный диагностикум Препарат представляет собой 10 % взвесь в 10 % растворе формалина эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном, полученным из туляремийных бактерий. Активность препарата испытывается при помощи РНГА с лошадиной, агглютинирующей, диагностической туляремийной сывороткой с титром в реакции агглютинации не ниже 1:1600. Если титр этой сыворотки в РНГА с сенсибилизированными эритроцитами ниже, чем 1:20000, они признаются негодными. Для постановки реакции применяется 2,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Препарат предназначен для обнаружения антител (в РНГА и РТНГА) и антигена туляремийных бактерий (в реакции нейтрализации). Срок годности препарата — 9 месяцев. Туляремийная диагностическая сыворотка Для диагностики туляремийных микробов и обнаружения их антигенов применяется сыворотка лошадей, баранов, кроликов, иммунизированных туляремийным антигеном. Сыворотка выпускается с титром не ниже 1:20 в реакции преципитации. Допускается реакция с гетерологичными микробами в титрах не выше 1/10 титра реакции с гомологичными микробами. Срок годности жидкой сыворотки — 2 года, сухой — 3 года. Люминесцирующие туляремийные антитела Для обнаружения туляремийных микробов и их антигенов в мазках из различных материалов от больных людей и животных (кровь, костный мозг), биопробного материала, из первичных культур, подлежащих окончательной идентификации, и некоторых объектов внешней среды, могут быть использованы люминесцирующие туляремийные антитела, сообщающие яркую люминесценцию возбудителям туляремии и их антигенам и не действующие таким образом на другие гетерологичные микроорганизмы. Туляремийный диагностикум для реакции агглютинации Для серологической диагностики туляремии и для обнаружения иммунологических сдвигов в организме человека и животных при изучении вакцинных штаммов и вакцины широко используется постановка реакции агглютинации с сыворотками больных или привитых людей и иммунизированных или инфицированных животных. В качестве антигена для обнаружения антител служит туляремийный диагностикум. Препарат представляет собой взвесь убитых формалином (0,5 %) туляремийных микробов вакцинного штамма. Диагностикум содержит 25 млрд. микробных тел по туляремийному стандарту в 1 мл формалинизированного физиологического раствора; при постановке объемной реакции агглютинации его разводят в 5 раз физиологическим раствором. Препарат разливают в ампулы по 1 мл и контролируют на стерильность путем посева на желточную среду и слабо щелочной агар, агглютинабельность со специфической противотуляремийной сывороткой и отсутствие агглютинации с нормальной сывороткой и физиологическим раствором. В кровянокапельной реакции применяется цельный диагностикум. При наличии в сыворотке крови агглютининов в титре 1:100 и выше положительная реакция должна наступать немедленно после смешивания крови с диагностикумом и быть резко выраженной.
