Способ получения чистых культур

Способы получения чистых культур

Существует ряд методов получения чистых культур микроорганизмов. Наиболее распространенными способами получения чистых культур в производственных условиях являются методы истощающего посева, основанные на механическом разделении клеток и выращивании их потомства в виде изолированных колоний:

5.2.1 истощающий посев газоном;

5.2.2 истощающий посев штрихом по секторам;

5.2.3 истощающий посев розливкой.

5.2.1 Истощающий посев газоном

Посев производится на трех пронумерованных чашках Петри (1,2,3) с питательной средой. Посев производится простерилизованным в пламени спиртовки и охлажденным стеклянным шпателем Дригальского.

На поверхность питательной среды в чашке 1 наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю исследуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей питательной среде. При этом чашку приоткрывают левой рукой настолько, чтобы в щель мог пройти только лишь шпатель.

Вынимают шпатель из чашки 1, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку 2, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды, прикасаясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке 1. Чашку 2 закрывают.

Затем переносят шпатель в чашку 3 и растирают материал по поверхности среды. Закрывают чашку, шпатель прожигают или опускают в дезинфицирующий раствор. Чашки подписывают и ставят в термостат вверх дном. Через сутки на чашке 1, где было много материала, получается сплошной рост бактерий, и отдельных колоний нет. На чашке 2 и, в особенности на чашке 3, колонии распределились изолированно. Поэтому они легко доступны исследователю.

5.2.2 Истощающий посев штрихом по секторам

Соблюдая правила стерильности, разливают питательную среду в чашки Петри. Затем дают среде остыть, слегка подсушивают ее в термостате. Затем чашку переворачивают вверх дном и расчерчивают карандашом по стеклу на четыре сектора. Чашку переворачивают крышкой вверх.

Приоткрыв чашку Петри, на один из секторов наносят каплю микробной взвеси, распределяют петлей на небольшой площадке, затем делают посев штрихом поочередно в каждом секторе. Сеять нужно осторожно, слегка прикасаясь петлей, чтобы не повредить среду. Посевы подписывают и термостатируют. Через сутки в первых секторах наблюдается сплошной рост по штриху, а в последнем секторе вырастают изолированные колонии.

5.2.3 Истощающий посев розливкой

Этот метод получения чистых культур был впервые предложен Робертом Кохом и поэтому иначе называется методом пластинчатых разводок Коха или методом чашечных культур Коха.

При выделении чистой культуры бактерий методом Коха основным условием является предварительное разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательной среде выросли изолированные колонии. Этот метод употребляется в тех случаях, когда нужно произвести количественное определение микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала (вода, молоко, пиво, зерновая болтушка и т.д.). Разведение исследуемого материала можно производить как непосредственно в питательной среде при посеве, так и в стерильной водопроводной воде перед посевом.

Рисунок 4 — Выделение чистых культур методом

пластинчатых разводок Коха

В первом случае берут несколько пробирок с 9 см 3 МПА, расплавляют их в водяной бане, охлаждают до 50-55°С и помещают в стакан с водой, имеющий примерно такую же температуру. Стерильной пипеткой набирают 1см 3 исследуемого материала, вносят в первую пробирку с МПА и перемешивают. Получается первое разведение – 10 -1 (1:10). Второй стерильной пипеткой забирают 1см 3 разведения 10 -1 , переносят во вторую пробирку, перемешивают, получая разведения 10 -2 (1:100) и т.д. Количество пробирок, взятых для опыта, зависит от степени загрязненности исследуемого материала. Затем полученные разведения в питательной среде выливают в чашки Петри, предварительно согретые в термостате во избежание неравномерного застывания агара. Пробирки берут по порядку, обжигают край, вливают содержимое в чашку Петри, открывая их настолько, чтобы в щель вышло лишь устье пробирки.

Опорожненные пробирки опускают в дезинфицирующий раствор. Покачивая чашки, распределяют МПА равномерно по всей поверхности дна.

Во втором случае проводят аналогичное разведение исследуемого материала, но в стерильной водопроводной воде, получая разведение 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 и т.д. Затем забирают отдельными стерильными пипетками из каждой пробирки по 0,1-1 см 3 соответствующего разведения, вносят в стерильные чашки Петри, осторожно приподнимая их крышки, и заливают примерно 10 см 3 расплавленного, но охлажденного до 45°С МПА. Легким покачиванием чашки среду равномерно распределяют по дну и дают ей застыть. Затем чашки переворачивают вверх дном, подписывают и ставят в термостат для выращивания микроорганизмов.

Источник

Способы получения чистых культур

Существует ряд методов получения чистых культур микроорганизмов. Наиболее распространенными способами получения чистых культур в производственных условиях являются методы истощающего посева, основанные на механическом разделении клеток и выращивании их потомства в виде изолированных колоний:

5.2.1 истощающий посев газоном;

5.2.2 истощающий посев штрихом по секторам;

5.2.3 истощающий посев розливкой.

5.2.1 Истощающий посев газоном

Посев производится на трех пронумерованных чашках Петри (1,2,3) с питательной средой. Посев производится простерилизованным в пламени спиртовки и охлажденным стеклянным шпателем Дригальского.

На поверхность питательной среды в чашке 1 наносят петлей или стерильной пастеровской пипеткой каплю исследуемого материала и растирают ее стерильным шпателем, двигая его сначала взад и вперед на небольшом участке, а затем круговыми движениями по всей питательной среде. При этом чашку приоткрывают левой рукой настолько, чтобы в щель мог пройти только лишь шпатель.

Вынимают шпатель из чашки 1, закрывают ее и быстро переносят шпатель в чашку 2, не прожигая его. Растирают материал по всей поверхности среды, прикасаясь к ней той же стороной шпателя, которой растирался материал в чашке 1. Чашку 2 закрывают.

Затем переносят шпатель в чашку 3 и растирают материал по поверхности среды. Закрывают чашку, шпатель прожигают или опускают в дезинфицирующий раствор. Чашки подписывают и ставят в термостат вверх дном. Через сутки на чашке 1, где было много материала, получается сплошной рост бактерий, и отдельных колоний нет. На чашке 2 и, в особенности на чашке 3, колонии распределились изолированно. Поэтому они легко доступны исследователю.

5.2.2 Истощающий посев штрихом по секторам

Соблюдая правила стерильности, разливают питательную среду в чашки Петри. Затем дают среде остыть, слегка подсушивают ее в термостате. Затем чашку переворачивают вверх дном и расчерчивают карандашом по стеклу на четыре сектора. Чашку переворачивают крышкой вверх.

Приоткрыв чашку Петри, на один из секторов наносят каплю микробной взвеси, распределяют петлей на небольшой площадке, затем делают посев штрихом поочередно в каждом секторе. Сеять нужно осторожно, слегка прикасаясь петлей, чтобы не повредить среду. Посевы подписывают и термостатируют. Через сутки в первых секторах наблюдается сплошной рост по штриху, а в последнем секторе вырастают изолированные колонии.

5.2.3 Истощающий посев розливкой

Этот метод получения чистых культур был впервые предложен Робертом Кохом и поэтому иначе называется методом пластинчатых разводок Коха или методом чашечных культур Коха.

При выделении чистой культуры бактерий методом Коха основным условием является предварительное разведение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале с таким расчетом, чтобы при посеве его на питательной среде выросли изолированные колонии. Этот метод употребляется в тех случаях, когда нужно произвести количественное определение микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала (вода, молоко, пиво, зерновая болтушка и т.д.). Разведение исследуемого материала можно производить как непосредственно в питательной среде при посеве, так и в стерильной водопроводной воде перед посевом.

Рисунок 4 — Выделение чистых культур методом

пластинчатых разводок Коха

В первом случае берут несколько пробирок с 9 см 3 МПА, расплавляют их в водяной бане, охлаждают до 50-55°С и помещают в стакан с водой, имеющий примерно такую же температуру. Стерильной пипеткой набирают 1см 3 исследуемого материала, вносят в первую пробирку с МПА и перемешивают. Получается первое разведение – 10 -1 (1:10). Второй стерильной пипеткой забирают 1см 3 разведения 10 -1 , переносят во вторую пробирку, перемешивают, получая разведения 10 -2 (1:100) и т.д. Количество пробирок, взятых для опыта, зависит от степени загрязненности исследуемого материала. Затем полученные разведения в питательной среде выливают в чашки Петри, предварительно согретые в термостате во избежание неравномерного застывания агара. Пробирки берут по порядку, обжигают край, вливают содержимое в чашку Петри, открывая их настолько, чтобы в щель вышло лишь устье пробирки.

Опорожненные пробирки опускают в дезинфицирующий раствор. Покачивая чашки, распределяют МПА равномерно по всей поверхности дна.

Во втором случае проводят аналогичное разведение исследуемого материала, но в стерильной водопроводной воде, получая разведение 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 и т.д. Затем забирают отдельными стерильными пипетками из каждой пробирки по 0,1-1 см 3 соответствующего разведения, вносят в стерильные чашки Петри, осторожно приподнимая их крышки, и заливают примерно 10 см 3 расплавленного, но охлажденного до 45°С МПА. Легким покачиванием чашки среду равномерно распределяют по дну и дают ей застыть. Затем чашки переворачивают вверх дном, подписывают и ставят в термостат для выращивания микроорганизмов.

Источник

Чистые культуры: понятие, определение, выделение, среда, получение и использование

Чистые культуры – ключевая догма микробиологии XX века. Для понимания сути данного понятия стоит вспомнить, что бактерии очень малы и морфологически трудноразличимы. Но они отличаются по биохимическим процессам, и именно это является их главной видовой особенностью. Но в обычной среде мы имеем дело не с одним видом бактерий, а с целым биомом – сообществом, которое влияет друг на друга, и выделить роль одного микроорганизма невозможно. И вот тут нам и нужна чистая культура или штамм конкретного вида.

«Охотники за микробами» и агар-агар

Гениальная идея выделения чистых культур микробов принадлежит медицинскому микробиологу Генриху Герману Роберту Коху (1843-1910). Тому самому, который открыл возбудителя сибирской язвы, холеры и туберкулеза и заслуженно считается основоположником бактериологии и эпидемиологии.

Именно он изобрел метод чистых культур, когда на питательную среду на основе полисахарида агар-агара наносится разбавленная культура микробов и из одной клетки вырастает колония совершенно идентичных организмов. Она хорошо видна невооруженным глазом и специфична для каждого вида.

Его изобретение дало толчок к развитию микробиологии и таксономии микроорганизмов. Ведь так можно было любой микроб культивировать в чистом виде и исследовать сто миллионов клеток как одну.

Не умаляя достижений Коха

Стоит отметить, что в данное изобретение внесли вклад соратники и ученики Коха. Так, идея с использованием агар-агара принадлежит Фанни Анжелине Гессе, жене ассистента Коха — В. Гессе.

Еще один помощник Коха бактериолог Юлиус Рихард Петри (1852-1921) предложил выращивать колонии бактерий в плоских стеклянных чашках. Сегодня о чашках Петри знают даже школьники.

Догма микробиологии

Чистая (аскеничная) культура – совокупность (популяция или штамм) микроорганизмов, которые имеют идентичные морфологические и биохимические свойства и являются потомками одной клетки.

Выделение чистой культуры предполагает осуществление трех этапов:

• Получение и накопление культуры микроорганизмов.
• Выделение чистой культуры.
• Определение и проверка чистоты культуры.

Методы выделения чистых культур

В микробиологии используются следующие методы для получения аксеничной культуры организмов:

• Механические методы (посев на чашки Петри при помощи шпателя или петли, посев при помощи разведения материала в агаре – пластинчатые разводки, метод разделения на основании подвижности микроорганизмов).
• Биологический – метод, при котором заражают чувствительных к патогену лабораторных животных. Так выделяют чистые культуры бактерий из организма мышей (например, пневмококков и палочки туляремии).
• Методы, которые основаны на избирательной резистентности микроорганизмов к определенным факторам. При нагревании, например, погибнут все спорообразующие бактерии, а неспорообразующие останутся в чистой культуре. При воздействии кислотами гибнут чувствительные к ним бактерии, а кислотоустойчивые (например, палочки туберкулеза) выживают. Воздействие антибиотиков оставляет на среде чистую культуру микроорганизмов, не чувствительных к нему. Создание кислородной и бескислородной среды отделит аэробов от анаэробов.

Для чего это необходимо

Чистые культуры применяются:

• В научной таксономии при классификации (определении филогенетического места в системе) микроорганизмов.
• В изучении наследственности и изменчивости организмов.
• При инфекционной диагностике и выявлении возбудителей заболеваний.
• При выделении чистой культуры бактерий, которые приводят к порче продуктов питания.
• При производстве витаминов, ферментов, антибиотиков, сывороток и вакцин.
• В пищевой промышленности (производство хлеба, вина, кваса и пива (уксусные бактерии и одноклеточные грибы дрожжи), молочнокислая продукция (лактобактерии и молочнокислые бактерии)).
• В биотехнологии и при изучении вирусов.

В природе все совсем не так

В 90-е годы прошлого столетия в отношении чистых культур все вдруг изменилось. Выяснилось, что при соединении микроорганизмов двух чистых штаммов в одной пробирке они ведут себя совсем не так, как поодиночке. Биохимические процессы их жизнедеятельности влияют (подавляют или стимулируют) друг на друга. Именно так и происходит в природных биомах.

Вывод прост: свойства чистой культуры в лаборатории не могут быть экстраполированы на природные биомы.

Геномная революция

Еще один удар был нанесен геномной идентификацией микроорганизмов. Изначально для геномного анализа микроорганизмов молекулярными генетиками был выбран общий для всех бактерий участок рибосомальной РНК. В соответствии с различиями в последовательности нуклеотидов в этой нуклеиновой кислоте все бактерии были распределены по признаку филогенетического родства.

Вот тут-то и оказалось, что культурные штаммы и те бактерии, которых мы изучили, составляют порядка 5% всех бактерий, населяющих нашу планету. И, в отличие от культурных штаммов, об их свойствах и особенностях биохимии мы ничего не знаем.

Найдя соответствующую последовательность в геноме природного штамма, мы можем только разместить его на филогенетическом древе и предположить, что в природе он имеет те же свойства, что и ближайший родственный штамм чистой линии.

И что же дальше?

Пока еще в будущем секвенирование генома бактерии по одной единственной клетке. Сегодня пока это дорого и очень сложно. И поэтому чистые линии остаются «золотым запасом» микробиологии.

Хотя сложности остаются. Например, совсем недавно были исследованы бактерии «черных курильщиков», расположенных на дне океана. Микроорганизм описали и секвенировали его геном без выделения чистой культуры.

Похожая ситуация сложилась и с бактериями, живущими в глубине золотобывающих шахт. Оказалось, что это чистая линия микроорганизмов – потомки одной бактерии.

При этом эти организмы не растут на питательных средах, и вырастить колонию чистого штамма пока никому не удалось.

Новости биотехнологии

В развитии этой отрасли прикладного знания перед человечеством стоит множество вопросов. И не только биологических, но и этических. Насколько человек может изменить окружающий мир и не навредить ему? Вопрос остается открытым.

Но уже сегодня биотехнологии внедряются в нашу жизнь. Так, уже сегодня выведены штаммы бактерий, которые способны питаться пластиком и разлагать его. Пока они делают это медленно. Но ученые работают над их геномом. Никого уже не удивляет, что весь человеческий инсулин нам «изготавливают» генномодифицированные бактерии кишечной палочки.

А искусственный биосинтез уже сегодня поставляет нам биогаз и биотопливо в виде высокомолекулярных углеводов природного происхождения (продукты жизнедеятельности бактерий, простейших грибов, которые перерабатывают биомассу наших отходов в топливо, энергию, химикаты).

Пахотные земли и пресная вода – сегодня это самый важный компонент из ограниченных природных ресурсов. Новые биотехнологии (биоремедиация) предлагает возможности использования микроорганизмов для восстановления их потенциальных возможностей и удаления загрязняющих факторов.

И это все — будущее, которое уже наступило.

Источник