Способ окраски по ожешко

Содержание

Окраска спор по методу Ожешко
Окраска по способу Ожешки
Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов.
Окраска по методу Ожешко для выявления спор

Окраска спор по методу Ожешко

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогреть в течение 2—3 мин на пламени.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.

3. Окрасить по методу Циля—Нильсена.

Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий имеют многослойную клеточную стенку сложного строения, практически непроницаемую для красителей, поэтому для повышения их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустойчивых бактерий.

Окраска спор по методу Шеффера—Фултона

1. На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3—4 раза нагреть до появления паров.

2. Промыть водой.

3. Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.

4. Промыть водой, высушить и микроскопировать.
Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив
ные клетки — в красный.

Источник

Окраска по способу Ожешки

Метод Ожешки применяется для выявления спор. Этапы окраски:

1) на нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают на пламени спиртовки 2-3 минуты;

2) кислоту сливают, препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем ;

3) окрашивают по Циль-Нильсену.

Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы в синий (рис.5).

Обнаружение капсул по методу Бурри-Гинса

1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.

2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мн.

3. Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать. Бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно- розовом фоне (рис.6).

Методы определения подвижности бактерий

Микроскопические

Определение подвижности микроорганизмов методом

«раздавленной капли»

Жгутики являются органами движения бактерий, состоят из белка флагеллина. По количеству и характеру расположения жгутиков различают бактерии: монотрихи, лофотрихи, амфитрихи и перитрихи. Жгутики обладают антигенными свойствами (Н-антиген) и дают возможность бактериям перемещаться в жидкой среде.

О наличии жгутиков можно судить по характеру движения бактерий в «раздавленной» и «висящей» каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло. Сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Метод Шукевича

Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева.

Дата добавления: 2019-04-03 ; просмотров: 669 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов.

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии.

С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Приготовление мазка «раздавленная капля».На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла. Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне. При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне.

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой–либо одной краски (или метиленового синего или фуксина). Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения).

Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла).

Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин. После фиксации мазок готов к окрашиванию.

Методика окраски по Граму.Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.

1. На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.

2. Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.

3. Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.

4. Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.

5. После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.

Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.

1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.

2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.

3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.

4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.

Методика окраски по Ожешко.Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.

1. На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.

2. Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.

3. Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.

4. После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.

Методика окраски по Цилю-Нильсенудля кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.

1. Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.

2. Дают препарату остыть, промывают водой.

3. Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.

4. Препарат промывают водой.

5. окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.

6. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

Тесты по теме:

1. Метод окрашивания для выявления капсул:

г) Цилю- Нильсену

2. Метод окрашивания для выявления спор:

г) Цилю- Нильсену

3. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по методу:

г) Цилю- Нильсену

4. Дифференциально-диагностическая окраска бактерий:

Источник

Окраска по методу Ожешко для выявления спор

На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5%-ного раствора соляной кислоты и подогревают 1 – 2 мин. над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.

Остывший препарат промывают водой, подсушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

Окрашивают карболовым фуксином Циля (фуксин наливают на фильтровальную бумажку) с подогреванием до появления паров.

Обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.

Докрашивают синькой Леффлера или 1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 3 – 5 мин.

Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Леффлера – синий цвет, при применении малахитовой зелени – зеленый цвет.

Особенности биологии вирусов

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий.

Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики(пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.

Тип симметрии.Капсидили нуклеокапсидмогут иметь спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии. Икосаэдрическийтип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральныйтип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм).

Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию.

Вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также растения и бактерии. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, вирусы также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирус краснухи, цитомегаловирус и др.), поражая плод человека. Они могут приводить к постинфекционным осложнениям — развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов и др.

Кроме обычных вирусов, известны и так называемые неканонические вирусы — прионы — белковые инфекционные частицы, являющиеся агентами белковой природы, имеющие вид фибрилл размером 10—20×100—200 нм. Прионы, по-видимому, являются одновременно индукторами и продуктами автономного гена человека или животного и вызывают у них энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции (болезни Крейтц-фельдта—Якоба, куру и др.).

Другими необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды — небольшие молекулы кольцевой, суперспи-рализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие заболевания у растений.

Структура и химический состав вирусов и бактериофагов

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.

Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды.

Источник