Способ окраски по нейссеру

Методика окраски по Нейссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 1 минуту, затем сливают краску.

2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 секунд.

3. Далее окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина – в темно-синий, почти черный цвет.

Метод Бурри-Гинса (выявление капсулы)

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают кра­ситель, и для их выявления чаще всего применяют метод нега­тивного контрастирования.

Методика окраски по Бурри-Гинсу

1. На середину предметного стекла наносят капельку черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени го­релки.

3. Окрашивают 5 минут карболовым фуксином, разведен­ным водой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Самостоятельная работа студента

На практическом занятии

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Изучить метод окраски по Граму	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Граму. 2. Поставьте опыт окраски по Граму. Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом, и в чем оно состоит; опреде­лить, в каких случаях целесообразно применение метода окраски по Граму. Материал: стафилококки (грамположи­тельные бактерии) и кишечные палочки (грамотри-цательные бактерии). Ход опыта: приготовить три одинако­вых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; окрасить один ма­зок водным фуксином, второй – генцианвиолетом, третий – по Граму. Результат: три рисунка и их описание. Вывод: (вывод содержит ответы на во­просы, поставленные в цели опыта).
II. Изучить метод окраски по Цилю-Нильсену	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Цилю-Нильсену. 2. Поставьте опыт окраски по Цилю-Нильсену. Цель опыта: определить, имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым способом окраски, и в чем оно состоит; в каких случаях целесо­образно применение этого метода. Материал: два мазка из смеси туберку­лезной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечных палочек (кислотоподатливые бактерии). Ход опыта: окрасьте один мазок про­стым способом (метиленовой синью), второй — по Цилю-Нильсену. Результат: два рисунка и их описание. Вывод. 3. Изобразите критерии окраски по Ци­лю-Нильсену в виде схемы.
III. Сдать выполненную работу препода­вателю	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.
IV. Изучить капсулы бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте демон-страционный препарат из культу­ры палочки Фридлендера, окрашен­ный по способу Гинса; капсулы на ри­сунке укажите стрелкой.
V. Изучить споры бак­терий	Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры антракоидной палочки, окрашенной по способу Циля-Нильсена; споры на рисунке отметьте стрелкой.
VI. Изучить жгутики бактерий и подвиж-­ ность	1. Внимательно проследите за демонстра­цией преподавателем техники приго­товления и микроскопирования пре­паратов «раздав-ленной» и «висячей» капли. Приготовьте препараты из культуры подвижных бактерий. 2. Промикроскопируйте демонстрацион­ные пробирки с полужидким агаром, засеянные подвижными и неподвиж­ными микробами. Результаты зарисуйте и дайте объясне­ние их в дневник.
VII. Изучить включения бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте готовые мазки из культур дифтерийной и сенной палочек. Включения на рисунке отметьте стрел­кой и объясните в дневнике причину окраски тела и включений бактерий в разные цвета.
VIII. Изучить ультра- микроскопическую структуру бактерий	Посмотрите таблицы с электронограммами бактерий и обсудите вместе с преподавателем тонкую структуру клеточной стенки, строение цитоплазматической мембраны, включений.
IX. Сдать выполненную работу	Продемонстрируйте преподавателю приготов-ленные Вами препараты «раздавленной» и «висячей» капли, технику их микроскопии; дайте на просмотр преподавателю тетради; приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Контрольные вопросы

1. Перечислить основные этапы развития микробиологии и фамилии ученых, работы которых определили появление новых этапов.

2. Перечислите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова.

3. Назовите отрасли микробиологии.

4. Основные разделы медицинской микробиологии.

5. Классификационные категории в микробиологии. Что та­кое бинарная номенклатура?

6. Как пишутся названия микробов (приведите примеры), группы микроорга­низмов?

7. Основные формы бактерий.

8. Как называются кокки, располагающиеся попарно? Цепоч­кой? Гроздьями? По четыре? Пакетами?

9. Как называются палочки, образующие споры? Не обра­зующие споры?

10. Как называются извитые формы с одним завитком спирали? С несколькими завитками спирали?

11. Каким будет общее увеличение микроскопа: окуляр ×10, объектив 8? Окуляр ×10, объектив 40? Окуляр ×10, объектив 90?

12. Чему равна разрешающая способность микроскопа с иммер­сионным объективом? Какова роль иммерсионного масла?

13. Перечислите структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные.

14. Оболочка бактерий, ее биологическая роль.

15. Какую форму принимает цитоплазма, искусственно лишен­ная оболочки?

16. Способ выявления оболочки.

17. Капсула, ее биологическая роль у патогенных бактерий.

18. Способ выявления капсулы в препаратах.

19. Перечислите патогенные бактерии, образующие капсулу.

20. Перечислите спорообразующие палочки.

21. Биологическая роль спор.

22. Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого процесса.

23. Процесс прорастания вегетативных форм бактерий из спор.

24. Как могут располагаться споры в теле бактерий?

25. Способ выявления спор в препаратах.

26. Включения бактерий, их биологическая роль, способ выяв­ления.

27. Биологическая роль жгутиков у бактерий. Как можно уви­деть жгутики у бактерий?

Часть II

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Тема:«Питание и дыхание бактерий. Питательные среды.

Выделение чистых культур аэробов и анаэробов. Бактериологический метод исследования»

Цель:

– на основании знания особенностей физиологии мик­роорганизмов

научиться проводить бактериологиче­ский метод исследования.

Задачи:

– освоить механизм питания и дыхания бактерий;

– научиться методам культивирования аэробов и анаэробов;

– овладеть основными методами микробиологи­ческой техники;

– уметь выбрать питательную среду для культиви­рования микробов

(аэробов и анаэробов);

– овладеть методами выделения чистых культур и их

Изучение физиологических и биохимических свойств мик­робов требует специальных методик исследования, в соот­ветствии с чем в данном разделе изложены основы микробиоло­гической техники, методы выделения чистых культур, идентифи­кации, методы приготовления питательных сред, методы стери­лизации и т.д.

Знание бактериологических методов исследования патоло­гического материала служит основой для изучения всех после­дующих разделов микробиологической диагностики. Прежде всего, необходимо выделить чистую культуру бактерий. Для ее получения необходимо иметь питательные среды и владеть методами выделе­ния чистой культуры.

Для культивирования микроорганизмов в баклабораториях используются искусственные питательные среды.

По химическому составу и характеру биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) прокариотические клетки не отличаются от эукариотических. Основными химическими компонентами бактериальной клетки являются органогены (кислород, водород, углерод, азот, фосфор). Процесс, в ходе которого бактериальная клетка получает из окружающей среды компоненты, необходимые для построения ее биополимеров, называется питанием.

Метаболизмбактерий представляет собой совокупность двух противо­положных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Ана­болизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии. Метаболизм бак­терий исследуют с помощью биохимических и физико-химических методов в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на питатель­ных средах, содержащих те или иные субстраты.

К особенностям метаболизма у бактерий относятся:

§ преобладание процессов диссимиляции над процессами ассимиляции;

§ высокая интенсивность процессов метаболизма, обусловленная тем, что соотношение поверхности к единице массы больше, чем у многоклеточных;

§ очень широкий субстратный спектр потребляемых бактериями ве­ществ – от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соеди­нений, включая антропогенные вещества – загрязнители окружающей среды;

§ очень широкий набор ферментов – это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов.

Ферменты бактерий делятся на следующие группы: экзоферменты, вы­деляемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (напри­мер, протеазы, полисахаридазы, олигосахаридазы), и эндоферменты, дей­ствующие на субстраты внутри клетки (например, ферменты, расщепляю­щие аминокислоты, моносахары, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но его регуляция идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних ферментов репрессируется, а для других инициируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (например, β-галактозидаза, β-лактамаза) называются индуцибельными. Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными. Они в определенных концентрациях всегда содержатся в микробных клетках.

Для диагностики, изучения и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.

Источник

Метод окраски по Нейссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску.

2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 сек.

3. Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина — в темно-синий, почти черный цвет.

Нуклеоид

Нуклеоид – ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг центрального стержня, состоящего из РНК и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1-3х10 9 , константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х10 7 нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток обуславливает его название: у первых – нуклеоид (образование подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная информация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, репарации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется краситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.

Метод окраски ДНК по Фельгену

1. Мазок из культуры бактерий фиксируют 2-3 мин метиловым спиртом и помещают в холодную 1% HCl на 1 мин.

2. Подвергают гидролизу при 60 0 С в 1% HCl 5-10 мин и споласкивают дистиллированной водой.

3. Помещают мазок в реактив Шиффа на 40-60 мин, промывают в водопроводной воде 2 мин.

В результате взаимодействия свободных альдегидных групп с бесцветной фуксинсернистой кислотой появляется фиолетовая окраска, свойственная основному фуксину.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды. Они представляют собой замкнутые в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500-40 000 пар нуклеотидов и содержащие до 100 генов.

Плазмиды могут существовать в клетке и в интегрированном состоянии с бактериальной хромосомой, сохраняя при этом способность переходить к автономии.

Капсула

Капсула – слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинса

1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Жгутики

Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бактериям передвигаться со скоростью 20-60 мкм/сек. Бактерии могут иметь один (монотрихи) или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности тела (перитрихи), либо собранные в пучки (лофотрихи).

Перитрихиальное расположение жгутиков характерно для энтеробактерий, возбудителей анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма; монотрихом является холерный вибрион, лофотрихом — псевдомонас. У некоторых видов спирилл различают амфитрихиальное расположение жгутиков. Толщина жгутиков в среднем составляет 10-30 нм, а длина достигает 10-20 мкм.

Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрилла), которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщенную изогнутую структуру- крюк и прикрепляется к базальной грануле, вмонтированной в клеточную стенку и ЦПМ (рис. 10).

Базальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из нескольких колец (одна пара у грамположительных бактерий, четыре — у грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового слоя клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к движению, хотя жгутики при этом остаются неповрежденными.

Рис. 10. Схематическая модель базального конца жгутика Е. coli, основанная на электронных микрофотографиях выделенной органеллы (Стейниер Р. и др., 1979).

Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с некоторым содержанием углеводов и РНК.

Под микроскопом жгутики можно увидеть лишь после специальных методов протравливания и импрегнации солями серебра и ртути с последующей окраской метиленовой синью (метод Леффлера). При этом необходимо учитывать, что жгутики очень чувствительны к различным механическим воздействиям. О наличии жгутиков можно косвенно судить по направленному характеру движения в «висячей» и «раздавленной» капле в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, либо при светлопольной микроскопии при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Окраска жгутиков методом Леффлера

В основе выявления жгутиков лежит осаждение на них красителя, чем достигается увеличение толщины жгутиков и уменьшение их прозрачности.

1. Препарат готовят из 16-18 часовой культуры, которую вносят в 1-2 мл стерильной водопроводной воды до получения тонкой опалесцирующей взвеси.

2. Через 20 мин капля суспензии наносят на поверхность чистого обезжиренного стекла и высушивают на воздухе.

3. Обрабатывают в течение 15 мин протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 25% водного раствора таннина, 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа.

4. Препарат промывают водой.

5. Окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным водой в соотношении 1:1, в течение 5 мин при легком подогревании.

6. Промывают водой, высушивают.

При микроскопии готового препарата жгутики видны как тонкие нитевидные структуры.

Ворсинки (фимбрии, пили)

Поверхность энтеробактерий и нескольких других микроорганизмов покрыта большим числом (от 10 до нескольких тысяч) ворсинок – нитевидных образований белковой природы. Как и жгутики, они построены из одного вида белка – пилина, субъединицы которого организованны в виде полой внутри нити и берут начало от ЦПМ. Они короче и тоньше жгутиков, их ширина 10-12 нм и длина до 12 мкм.

Ворсинки полифункциональны: обеспечивают трансмиссивную передачу генов (конъюгация), являются рецепторами для фагов, органом прикрепления бактерий к питательному субстрату (адгезия), участвуют в транспорте метаболитов.

У стрептококков имеется наружный слой протеиновых волосков (фимбрий), которые получили название белок М (М-протеин). Этот белок играет важную роль в процессах взаимоотношений бактерий с макроорганизмом.

Споры

Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны образовывать споры. Этому предшествует обеднение среды питательными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых продуктов метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка образует одну спору – локализация спор различна (центральная, терминальная, субтерминальная) (рис. 11).

Pис. 11. Типичные формы спорообразующих клеток. 1. Спора расположена в центре; материнская клетка не увеличена (Bacillus megaterium). 2. Спора расположена терминально, материнская клетка не увеличена; заметны белковые включения (Bacillus thuringiensis). 3. Спора расположена терминально, материнская клетка раздута в форме булавы (Bacillus polymyxa). 4. Спора расположена в центре; материнская клетка деформирована и приобрела форму веретена — клостридиальная форма (Bacillus polymyxa). 5. Спора расположена терминально; круглая материнская клетка имеет форму барабанной палочки — плектридиальная форма (Bacillus sphaericus). 6. Спора расположена латерально; материнская клетка приобрела веретенообразную форму (Bacillus laterosporus) (Шлегель Г., 1987).

Если размеры спор не превышают поперечного размера палочковидной бактерии, то последняя называется бациллой (возбудитель сибирской язвы). Когда диаметр споры больше – бактерии имеют форму веретена и носят название клостридий (возбудители анаэробной инфекции). Клостридии столбняка имеют круглую спору и напоминают барабанные палочки. Клостридии ботулизма отличаются большими овальными спорами, что придает им вид теннисной ракетки.

По химическому составу различие спор от вегетативных клеток состоит лишь в количественном содержании химических соединений. Споры содержат меньше воды и больше липидов.

Формирование спор связано с уплотнением и обособлением определенного участка цитоплазмы вегетативной клетки с последующим образованием внутри бактерии круглого или овального тельца, покрытого плотной многослойной оболочкой, которая пропитана большим количеством липидов, кальция, дипиколиновой кислоты (рис. 12).

Рис. 12. Схема образования споры. А и Б. Образование септы. В и Г. Окружение протопласта споры протопластом материнской клетки. Д. Образование кортекса и оболочек споры. Е. Схема строения зрелой споры. 1 — экзоспориум; 2 — наружная оболочка споры; 3 — внутренняя оболочка споры; 4 — кортекс; 5 — клеточная стенка зародыша; 6 — цитоплазматическая мембрана; 7 — цитоплазма с ядерным веществом (Шлегель Г., 1987).

После полного созревания споры вегетативная часть клетки может лизироваться. Среди патогенных микробов способностью к спорообразованию обладают только палочковидные грамположительные бактерии. Большинство из них подвижны, благодаря перитрихиально расположенным жгутикам.

В состоянии споры микроорганизмы метаболически неактивны, выдерживают высокую температуру (140°-150°С), воздействие химических дезинфицирующих веществ и длительно сохраняются в окружающей среде. Устойчивость к высокой температуре связана с очень низким содержанием воды и высоким содержанием дипиколиновой кислоты.

Попадая в организм человека и животных, споры прорастают в вегетативные клетки. Процесс прорастания спор включает три стадии: активации, начальной стадии и стадии роста. К активирующим агентам, нарушающим состояние покоя, относят повышенную температуру, кислую реакцию среды, механические повреждения и др. Спора начинает поглощать воду, освобождается от дипиколата кальция, с помощью гидролитических ферментов разрушает многие собственные структурные компоненты. После разрушения наружных слоев наступает период формирования вегетативной клетки с активацией биосинтеза, заканчивающейся делением клетки.

Окраску спор производят специальным методом, который включает предварительное прогревание споры, а также воздействие концентрированных растворов красок при высокой температуре.

Метод окраски спор по Ожешко

1. На высушенный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин.

2. Препарат промывают водой и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают по способу Циля-Нильсена.

Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются в красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной кислотой и после докрашивания метиленовым синим приобретает синий цвет.

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов – микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Дата добавления: 2016-08-07 ; просмотров: 3859 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник