Способ окраски микроорганизмов по граму

Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.

Результаты

Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы – отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.

Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.

Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках – пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.

При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные – обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.

Применение

Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.

Источник

Окрашивание бактерий по Граму

Окрашивание бактерий по Граму – метод окраски, позволяющий разделить данную группу прокариотичеких микроорганизмов на грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии [2] .

Окрашивание в фиолетовый цвет
грамположительной бактерии Bacillus thuringiensis

Грамотрицательные и грамположительные бактерии отличаются строением клеточной стенки. Метод окрашивания бактерий по Граму был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом [2] . К грамотрицательным бактериям, в частности, относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, семейство Псевдомонадовые (Pseudomonadaceae).

Основы и сущность метода

Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий [2] [1] .

Как уже было указано, все бактерии по этому признаку делят на две группы:

• грамположительные – красящиеся по Граму;
• грамотрицательные – не красящиеся по Граму [1] .

Техника окрашивания бактерий по Граму

Методика поверки бактерий на окрашивание по Граму включает следующие операции:

1. На обезжиренное предметное стекло наносят в трех местах три капли воды и готовят три тонких мазка различных видовбактерий. При этом по краям располагают контрольные мазки с заведомо известным отношением к окраске по Граму. В центре – мазок исследуемой культуры [1] .
2. Мазки высушивают и фиксируют в пламени спиртовки [1] .
3. Мазки окрашивают в течение одной минуты генцианвиолентом. Для этого на предметное стекло кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смачивают ее водой [1] .
4. Бумажку с красителем удаляют, на препарат наносят раствор Люголя (водой промывать не надо) и выдерживают 60 секунд, до полного почернения мазка [1] .
5. Не промывая водой, препарат обрабатывают 96% спиртом в течение 15–20 с. При этом предметное стекло покачивают. Важно четко соблюдать указанное время обесцвечивания, поскольку при увеличении его продолжительности наблюдается обесцвечивание и грамположительных бактерий[1] .
6. Препарат промывают водой и накладывают на его поверхность полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 60 секунд [1] .
7. Фильтровальную бумагу с красителем удаляют, препарат промывают водой и осушают чистой фильтровальной бумагой [1] .
8. На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом [1] .

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные – в красный [3] [1] .

Источник

Окрашивание бактерий методом Грама. Применение метода в клинической практике

Дата публикации: 31.05.2020 2020-05-31

Статья просмотрена: 979 раз

Библиографическое описание:

Лепихов, М. А. Окрашивание бактерий методом Грама. Применение метода в клинической практике / М. А. Лепихов. — Текст : непосредственный // Молодой ученый. — 2020. — № 22 (312). — С. 429-431. — URL: https://moluch.ru/archive/312/70882/ (дата обращения: 18.11.2021).

В статье автор описывает принцип окрашивания бактерий методам Грама, разбирается в причинах выделения грамположительных и грамотрицательных видов и в клинической важности окрашивания бактерий.

Ключевые слова: бактерии, грамположительные и грамотрицательные, окрашивание, резистентность, антибиотики

Бактерии широко распространены на нашей планете, как в окружающей среде, так и внутри тела человека. Многие из них чрезвычайно полезны и нашли свое применение во многих отраслях: фармакологии, медицине, пищевой промышленности. Однако стоит выделить две группы: патогенные и условно патогенные бактерии. Их особенность состоит в том, что они являются возбудителями инфекционных и воспалительных процессов [2].

Особый вклад в изучение этих групп бактерий внес Ганс Христиан Грамм — микробиолог из Дании, открывший метод окрашивания бактерий, применимый и в наше время. Согласно данному методу препарат необходимо зафиксировать — чаще всего это делается при помощи высокой температуры, однако есть и другие методы. Поскольку бактерии дают слабощелочную среду, зафиксированный препарат окрашивают основными красителями трифенилметановой группы, например, генцианвиолет, метилвиолет, кристаллвиолет. Для закрепления краски на поверхности бактерий применяется протравка — йод (часто применяют раствор Люголя), пикриновая кислота. На части бактерий краска прочно фиксируется и не обесцвечивается нейтральным спиртом или ацетоном, такие бактерии называются грамположительными. В другой группе краситель полностью обесцветится — это грамотрицательные бактерии. Для окрашивания этого типа бактерий необходимо применение специальной контрастной краски. Причин этого явления выделяют несколько. Первая — наличие у грамположительных бактерий ненасыщенных жирных кислот, которые могут связываться с йодом, что делает клеточную стенку непроницаемой для нейтрального спирта и последней не может проникнуть в клетку и обесцветить краситель в ней.

Другие авторы выделяют в качестве причины разность в кислотно-основных свойствах протоплазмы, считая, что изоэлектрическая точка грамотрицательных бактерий более смещена в щелочную среду. Если учесть, что йод в составе протравы является окислителем и смещает pH бактерий в кислую сторону. Из этого можно сделать вывод, что грамположительные бактерии будут проявлять более сильные кислотные свойства, то химические различия с грамотрицательными бактериями явны. Кроме того, можно подчеркнуть, что снижение изоэлектрической точки позволяет усилить связь с красителем у грамположительного штамма.

Согласно химической теории, разность в окрашивании обусловлена наличием на клеточной стенке грамположительных бактерий комплекса белка с рибонуклеатом магния. Опытным путем доказано, что после удаления данного комплекса с поверхности грамположительной бактерии, повторное окрашивание показывает бактерию как грамотрицательную.

Другой причиной неодинаковой окраски является различие в клеточной стенке, ее толщине и проницаемости. У грамположительных бактерий она достаточно широкая, что способствует более глубокому проникновению в нее красителя, благодаря чему последний не поддается обесцвечиванию нейтральным спиртом. Важным является и содержание пептидогликанов — у этого типа оно велико. Необходимо учитывать и разность структуры пептидогликанов у грамположительной и грамотрицательной групп. Первая группа окрашивается в фиолетовый цвет и считается патогенной.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий более тонкая, чем у грамположительных бактерий, поэтому при промывании после окрашивания спирт обесцвечивает краситель, и характерная окраска исчезает. К грамотрицательным бактериям относят условно патогенные формы.

Разработанный Грамом метод применяется и в современной медицине. Бактериоскопия — метод визуального анализа биологического материала под микроскопом [4]. Процедура достаточно проста и позволяет определить бактериальное заражение и принадлежность бактерий к грамположительным или грамотрицательным.

Определение грамположительности и грамотрицательности является очень важным, поскольку позволяет определить восприимчивость исследуемого вида к антибиотикам, что, безусловно, влияет на назначения врача. Устойчивость связана с тонкостью, прочностью и низкой проницаемостью клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Эта особенность позволяет значительно снижать концентрацию антибиотика в пределах клетки бактерии. В связи с этим антибиотик не может воздействовать ни на структуры клетки-мишени, ни на ее ферментные реакции, ни на реакции синтеза [1].

Окраска по Граму позволяет не только определить резистентность к антибиотику, но и видовую принадлежность бактерии, что определяет диагноз пациента, а значит особенности лечения и подбора лекарственных препаратов. Все это, безусловно, важно в клинической практике.

К грамположительным относятся кокки, вибрионы, палочки, бациллы, корниебактерии, микобактерии, бифидобактерии и актиномицеты. (Таблица 1). Стрептококки и стафилококки провоцируют грибковые инфекции и вызывают фарингит, пневмонию, сепсис, синусит, отит, кроме того поражают мочевыводящие пути, сердце провоцируют нагноения ран. К данной группе также относятся возбудители газовой гангрены, туберкулеза, сибирской язвы, дифтерии, ботулизма, столбнячной инфекции и других.

К грамотрицательным относятся кокки, палочки, вибрионы, спириллы, спирохеты и др. (Таблица 1). Они окрашиваются сафранином в розово-красный цвет. Представители данного типа являются возбудителями таких гнойно-воспалительных заболеваний, как бруцеллез, хламидиоз, туляремия, чума, бактериальный менингит, язвенную болезнь желудка и другие нарушения желудочно-кишечного тракта, гонорею, сифилис и многие другие [3].

Грамположительные играмотрицательные формы бактерий

Таким образом, бактерии играют важную роль в жизни человека, не только участвуя в производственных процессах, но и вызывая заболевания. Болезнетворные бактерии принято подразделять на патогенные и условно патогенные (приводящие к болезни при ослаблении иммунитета или резких негативных изменениях условий обитания). По способности к окрашиванию бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные. Существует несколько причин, по которым вторая группа поддается осветлению нейтральными спиртами. Окрашивание бактерий является важным аналитическим признаком, позволяющем определить видовую принадлежность микроорганизма и его устойчивость к отдельным видам антибиотиков.

1. Caldwell R.,Lindberg D.: Understanding Evolution. University of California Museum of Paleontology (2011).
2. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: Учебник. — 2003. − 464 с.
3. Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов: в 3 т. — СПб.: Издательство С.-Петербургского университета, 2006. — ISBN 5–288–04056–7.
4. Суворов А. Л. Микроскопия в науке и технике / Отв. ред. д-р физ.-мат. наук В. Н. Рожанский; Академия наук СССР. — М.: Наука, 1981. — 136, [1] с. — (Наука и технический прогресс).

Источник