Гематология: методы Взятие крови из пальца Исследование морфологии эритроцитов Морфология лейкоцитов Методы исследования фагоцитоза in vitro Окраска по Райту Окраска по Лейшману. Окраска по Май-Грюнвальду Окраска по Нохту Окраска по Романовскому Окраска по Фрейфельд Определения Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. Получение лейкоконцентрата Приготовление и фиксация мазков крови Приготовление мазков крови унифицированным методом Ретикулоциты Цитопатология клеток крови. Эритроцитометрия Эритроциты
Окраска по Романовскому
Азур-эозин по Романовскому
Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.
Потенциальный риск применения набора – класс 2б.
При работе с набором необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
При работе с биологическими жидкостями следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как исследуемый материал является потенциально инфицированным, способным длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
Все использованные материалы дезинфицировать в соответствии с требованиями МУ-287-113.
Посуда и аппаратура.
•цилиндры мерные вместимостью 25 -1000 мл;
•калий фосфорнокислый однозамещенный;
•натрий фосфорнокислый двузамещенный;
•Штатив для мазков.
•Кювета со стеклянным мостиком для окраски.
Приготовление забуференной воды:
Взвесить на аналитических весах с точностью ±0,01 г 9,50 г натрия фосфорнокислого двузамещенного
безводного или 22,70 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного; навеску перенести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довести до 1000 мл дистиллированной водой и тщате льно перемешать (раствор 1).
Взвесить на аналитических весах с точностью ±0,01 г 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного; навеску внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл, добавить 900 мл дистиллированной воды, перемешать до растворения, довестидо 1000 мл дистиллированной водой и тщательно перемешать (раствор 2).
Внести в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл 63 мл раствора 1 и 37 мл раствора 2, довести до 1000 мл дистиллированной водой и определить рН полученной
забуференнойводы на рН-метре; рН должен находиться в диапазоне 6,8 — 7,2. Полученную забуференную воду можно хранить при комнатной температуре (+18/+25°С).
В продаже имеется готовый раствор краски Романовского, а также сухая краска Романовского (Гимзы), из которой приготовляют раствор следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта (последний хуже).
Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски.
Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 сут, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей.
Вновь полученный или приготовленный раствор красителя Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков крови в течение 25—40 мин различно разведенной краской (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают нужное количество капель краски на 1 мл воды и время окрашивания.
(методика окраски): Мазки необходимо зафиксировать фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду или типа Лейшмана в течение 2-3 минут. Непосредственно
перед окраской приготовить рабочий раствор: смешать краситель с забуференной водой в соотношении 1:20 — 1:45 и профильтровать.
Полученный рабочий раствор красителя можно использовать в течение 6 ч асов.
Зафиксированные мазки крови поместить в рабочий раствор красителя, по истечении 20-45 мин препараты промыть проточной водой 1-2 сек, высушить на воздухе и микроскопировать.
Окраска форменных элементов крови должна быть следующей:
эритроциты — розовые, розовые с серым или бежевым оттенком, бежево-коричневые;
тромбоциты — розово-фиолетовые или фиолетовые;
ядра лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов — фиолетовые;
цитоплазма лимфоцитов — голубая, серо-голубая или сине-голубая;
цитоплазма моноцитов- серо-голубая;
цитоплазма нейтрофилов — бледно-розовая или розово-серая;
зернистость нейтрофилов — фиолетовая или красно-фиолетовая;
зернистость эозинофилов- оранжево-красная, розово-красная или розово-фиолетовая;
зернистость базофилов- фиолетовая
Окраска по Романовскому в модификации Филипсона.
Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей -фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.
Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».
1.Одну часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта (ректификата) тщательно смешивают. Краска сразу же пригодна к употреблению, но можно готовить ее и заранее.
2. Дистиллированная вода нейтральной реакции.
Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью и
через 1 — 1мин30 сек, не сливая красителя, прибавляют к нему но каплям примерно столько же дистиллированной воды, следя за тем, чтобы вода при соединении с красителем не сливалась с мазка. Через 20—30 мин краситель смывают водой и мазок высушивают.
Этим способом клетки окрашиваются хорошо, но иногда, по-видимому, от недоброкачественности спирта в эритроцитах обнаруживаются мелкие пузырьки, мешающие определению степени насыщения их гемоглобином.
Способы быстрой окраски мазков краской Романовского по Алексееву.
Одновременная фиксация и окраска мазков с применением для ускорения окрашивания по первому способу подогрева дистиллированной воды и по второму способу — подогрева разведенной краски Романовского.
Посуда и аппаратура.
1. Глазные пипетки.
3. Темная бутыль с притертой пробкой емкостью 1 л. Остальное — см. «Окраска по Романовскому».
2. Краситель Лейшмана для второго метода (растворяют 4 г сухой краски в 1 л метилового спирта и хранят в темной посуде).
3. Чистый метиловый спирт.
4. Нейтральная дистиллированная вода.
5. Фильтровальная бумага.
1. На сухой нефиксированный мазок наносят глазной пипеткой 6—10 капель краски Романовского, распределяя ее той же пипеткой равномерным слоем. Через 30 с другой пипеткой добавляют к краске по каплям удвоенное количество подогретой до 50—60° дистиллированной воды. Покачиванием препарата перемешивают краску с водой и оставляют на 3 мин в покое, затем смывают ее дистиллированной водой и высушивают мазок фильтровальной бумагой. При этом методе окраски частично гемолизируются эритроциты, однако клетки белой крови не изменяются.
При втором способе, приводимом ниже, результаты получаются лучшей окраска препаратов мало отличается от обычной окраски по Романовскому.
2. На сукой нефиксированный мазок наливают равномерным слоем 10—12 капель краски Лейшмана. Через 20—30 с, не сливая краску, добавляют к ней нагретый до 50—60° раствор краски Романовского в количестве, способном удержаться на препарате. Через 3 мин, не сливая краску, смывают ее сильной струей дистиллированной воды и высушивают препарат фильтровальной бумагой.
Источник
Окраска мазков крови по Романовскому-Гимзе
Принцип данного способа окраски состоит в использовании свойства смеси основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок окрашивать различные элементы клеток в разные цвета и оттенки.
Высушенные на воздухе зафиксированные мазки крови окрашиваются специальными красителями, применяемыми для идентификации цитоморфологически важных структур в клетках крови. Кислые вещества клетки, такие как ДНК и хроматин, связывают основные красители (метиловый зеленый, метиленовый синий, азур и т. д.), и они выглядят базофильными. Основные клеточные субстанции, например, цитоплазма, окрашиваются кислыми красками (эозин, фуксин), и они становятся ацитофильными. Нейтральные компоненты клетки могут быть визуализированы с помощью нейтральных растворов красителей.
Посуда и аппаратура
1. Колба или бутыль вместимостью 1 л.
2. Измерительные цилиндры вместимостью 250 мл.
3. Цилиндры для разведения краски вместимостью 100 мл.
4. Градуированная пипетка.
5. Штатив для мазков.
6. Кювета со стеклянным мостиком для окраски.
В специализированных магазинах и офисах имеется в продаже готовый раствор краски Романовского, которая состоит из щелочной и кислой частей. Щелочная часть — азур II, а кислая часть — эозин. Азур II окрашивает в ярко-синий цвет, эозин — в розово-красный. Состав готового раствора краски Романовского следующий: азур II 3 г
эозин, водорастворимый, желтый 0,8 г
метиловый спирт 250 мл
глицерин 250 мл
В продаже имеется также сухая краска Романовского.
1- й способ. Из сухой краски приготовляют красящий раствор следующим образом. 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чистого метилового или этилового спирта (последний хуже). Раствор оставляют на 3-5 суток, часто взбалтывая для лучшего растворения краски. Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3-4 суток, периодически взбалтывая.
2- й способ. При необходимости ускорить процесс приготовления краски можно, взяв 3,8 г сухой красящей смеси, растворить ее в 250 мл глицерина при нагревании в течение 90-120 минут на водяной бане. При этом поддерживается постоянная температура 56 °С. Затем, остудив полученный раствор до комнатной температуры, прибавляют 250 мл чистого метилового спирта.
Вновь приготовленный раствор краски Романовского перед употреблением оттитровывают, то есть окрашивают несколько фиксированных мазков крови в продолжение 25-40 минут, применяя различно разведенную краску: 1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. По хорошо окрашенному препарату устанавливают время окрашивания и нужное количество капель краски на 1 мл разбавителя.
3- й способ. В настоящее время чаще всего используют готовый краситель Романовского-Гимзы, из которого перед началом работы приготовляют рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.
Источник
Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе
Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе — это один из самых популярных методов окрашивания бактерий, простейших, а так же клеточных структур и тканей самых различной структуры. Данный м метод используется в том числе и для исследований крови посредством световой оптической микроскопии. Окраска по Пинчуну-Романовского-Гимзе впервые была предложена в 1904 году Густавом Гимзой.
Посредством данного метода окраске подлежат ацидофильные образования в разные оттенки красного цвета. Образования базофильного характера окрашиваются в цвет от пурпурного до синего.
Момент окрашивания:
Перед началом окрашивания готовый краситель жидкого вида разводят в дистиллированной воде в соотношении 1-2 капель красителя на 1 мг воды. Мазки окрашиваются во влажной камере при температуре 37 °C в течение 20-25 минут. После завершения окраски мазки промываются проточной водой, сушатся на воздухе, а затем исследуются с помощью масляных импрессий.
Красящую смесь Романовского-Гимзы, в основе которой имеется краска Романовского Райта, растворяют в виде порошка в смеси равноправных объемах глицерина и метилового спирта в соотношении 800 мг красителя к 100 мл растворителя.
Краситель обладает плохой растворимостью, поэтому его следует перетереть с растворителем в количественном соотношении 300мг к 100 мг, затем, добавлять краситель при этом постоянно помешивать массу до получения требуемой концентрации. На приготовление красителя требуется несколько дней. Следует акцентировать внимание на том, что в качестве растворителей нужно применять химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как именно примеси являются причиной ухудшения свойств красителя. 100 % этиловый спирт может стать идеальной заменой метиловому спирту. Готовую красящую смесь следует хранить в плотно закрытом сосуде в прохладном сухом месте.
Специальный раствор Гимза. Составляющие красителя:
Азур 1 — 3,772 г
Эозин — 2,165 г
Метиленовая синька (медиц.) — 1,563 г
Метанол (ЧДА) — 750,0 мл
Глицерин (ЧДА) — 256,0 мл
Метод окрашивания:
Мазки, акцентированные в метиловом спирте, окрашивают на протяжении 40-120 минут раствором, в состав которого входят 1 мл приготовленной краски жидкой формы, 2 мл главного буферного раствора и 47 мл дистиллированной воды. Используют фосфатный буфер, на рН которого оказывает влияние вид мазка:
мазок костного мозга — 5,8 — 6,0;
мазок крови — 6,4 — 6,5;
выявление простейших — 6,8;
малярийные плазмодия — 7,0 — 7,2.
Ополаскивание проводят в дистиллированной воде, затем высушивают и изучают при иммерсии.
Результаты окрашивания:
Амастиготы Leishmania tropica, находящиеся – в макрофагах. Увеличение 10×100, окрашивание по Гимзе.
Бактерии вследствие окрашивания приобретают фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток — голубой цвет, ядра — красный. Вследствие окраски простейших их цитоплазма становится голубого цвета, а ядра — красно-фиолетового.
Как мы уже говорили, в микроскопы можно смотреть прозрачные и непрозрачные объекты (если микроскоп оборудован верхней подсветкой, либо при наличии яркого внешнего освещения). Однако маленькое рабочее расстояние объективов большой кратности делает невозможным исследование ряда объектов в отраженном свете, и поэтому для исследований большинства образцов необходимо готовить специальные микропрепараты.
Волосы у многих являются гордостью, но далеко не все знают, насколько они чувствительны и ранимы к воздействию на них внешних факторов.
Комментарии к статье «Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе»
Владимир Григорьев: Цитата: «Окраска по Пинчуну-Романовского-Гимзе впервые была предложена в 1904 году Густавом Гимзой.» Для справки: метод двойной окраски препаратов крови (катионный краситель азур B + анионный краситель эозин Y ) впервые предложен в 1889 г. российским врачом Ч. И. Хенцинским. В 1891 г. Д. Л. Романовский опубликовал свою диссертацию «К вопросу о паразитологии и терапии болотной лихорадки», имевшей сенсационный эффект для медицины того времени. Препараты крови Д. Л. Романовский окрашивал по методу своего российского коллеги. Соответственно, с работой Романовского Д.Л., получил мировую известность и метод окрашивания предложенный Ч. И. Хенцинским. В 1904 г. Г. Гимза (Gustav Giemsa) предложил улучшение одного из технологических аспектов раствора Романовского (добавление глицерина увеличивало растворимость и стабильность красителей). Работа Г. Гимзы называлась «Giemsasche Lözung für die Romanowsky färbung» (Раствор Гимзы для окраски по Романовскому), т.е. Гимза красил по Романовскому, в отличии от автора статьи. Работа с микроскопами предполагает точность и самодисциплину, поэтому такая неаккуратность несколько настораживает. С глубоким уважением, Григорьев В.А.
Метод окраски микропрепаратов по Романовскому-Гимзе — это один из самых популярных методов окрашивания бактерий, простейших, а так же клеточных структур и тканей самых различной структуры. Данный м метод используется в том числе и для исследований крови посредством световой оптической микроскопии. Окраска по Пинчуну-Романовского-Гимзе впервые была предложена в 1904 году Густавом Гимзой.
