Способ окраски мазков по граму

Окраска по Граму

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, «И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное.» В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Теория

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм) Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или липотейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками. Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий. С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами. Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран. Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра, и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями.

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные.

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя.

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.

Варианты окраски

«Классический» метод

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
6. Промыть и подсушить препарат

Модификация Hucker

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
7. Промыть и подсушить препарат

Модификация Burke

Красители и реактивы

Методика окраски

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин)
3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
6. Препарат высушить на воздухе.
7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
8. Промыть и подсушить препарат

Модификация Kopeloff-Beerman

Красители и реактивы

Методика окраски

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)
3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
6. Препарат высушить на воздухе.
7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
8. Промыть и подсушить препарат

Модификация Синева

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)
3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
5. Тщательно промыть дистиллированной водой.
6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
7. Промыть и подсушить препарат

Модификация Preston-Morrell (требует редакции)

Красители и реактивы

Методика окраски

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)
3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
7. Промыть и подсушить препарат

Ошибки

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)

1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску

Старая культура Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий — через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста Культура выращена в неблагоприятных условиях При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии) нет

Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)

Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении

1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной \»густотой\» мазка
2. Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
3. При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду

Мазок плохо обесцвечен

1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
2. Повторить приготовление препарата и его окраску
3. Дообесцветить имеющийся мазок
4. Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки — заменить раствор.

Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)

Источник

Окраска по Граму — Gram stain

Окрашивание по Граму или окрашивание по Граму , также называемое методом Грама , представляет собой метод окрашивания, используемый для различения и классификации видов бактерий на две большие группы: грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии . Название происходит от датского бактериолога Ганса Христиана Грама , который разработал эту технику.

Окрашивание по Граму позволяет дифференцировать бактерии по химическим и физическим свойствам их клеточных стенок . Грамположительные клетки имеют толстый слой пептидогликана в клеточной стенке, который сохраняет первичную окраску — кристаллический фиолетовый . Грамотрицательные клетки имеют более тонкий слой пептидогликана, который позволяет кристаллическому фиолетовому вымываться при добавлении этанола. Они окрашиваются в розовый или красный цвет из-за контрастного красителя , обычно сафранина или фуксина . Раствор йода Люголя всегда добавляют после добавления кристаллического фиолетового для усиления связи пятна с клеточной мембраной. Окрашивание по Граму почти всегда является первым шагом в предварительной идентификации бактериального организма. Хотя окрашивание по Граму является ценным диагностическим инструментом как в клинических, так и в исследовательских целях, не все бактерии могут быть окончательно классифицированы с помощью этого метода. Это дает начало группам с граммовой переменной и грамм-неопределенным.

СОДЕРЖАНИЕ

История

Метод назван в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грэма (1853–1938), который разработал эту технику во время работы с Карлом Фридлендером в морге городской больницы в Берлине в 1884 году. Грам разработал свою технику не для того, чтобы отличать один тип бактерий от другого, но сделать бактерии более заметными на окрашенных участках легочной ткани. Он опубликовал свой метод в 1884 году и включил в свой краткий отчет наблюдение о том, что тифовая палочка не сохраняет окраску.

Использует

Окрашивание по Граму — это бактериологический лабораторный метод, используемый для дифференциации видов бактерий на две большие группы ( грамположительные и грамотрицательные ) на основе физических свойств их клеточных стенок . Окрашивание по Граму не используется для классификации архей , ранее бывших археабактериями, поскольку эти микроорганизмы дают сильно различающиеся ответы, которые не соответствуют их филогенетическим группам .

Некоторые организмы являются грамм-переменными (это означает, что они могут окрашивать либо отрицательно, либо положительно); некоторые из них не окрашены ни одним из красителей, используемых в технике Грама, и не видны. В современной лаборатории экологической или молекулярной микробиологии большая часть идентификации выполняется с использованием генетических последовательностей и других молекулярных методов, которые гораздо более специфичны и информативны, чем дифференциальное окрашивание.

Медицинское

Граму проводят на теле жидкости или биопсии , когда инфекция подозревается. Окрашивание по Граму дает результаты намного быстрее, чем культивирование , и особенно важно, когда инфекция может иметь важное значение для лечения и прогноза пациента; примерами являются спинномозговая жидкость при менингите и синовиальная жидкость при септическом артрите .

Механизм окрашивания

Грамположительные бактерии имеют толстую сетчатую клеточную стенку, состоящую из пептидогликана (50–90% клеточной оболочки), и в результате окрашиваются в фиолетовый кристаллический фиолетовый, тогда как грамотрицательные бактерии имеют более тонкий слой (10% клеточной оболочки). конверт), поэтому не оставляют пурпурных пятен и окрашиваются в розовый цвет сафранином. Есть четыре основных этапа окрашивания по Граму:

• Нанесение первичного красителя ( кристаллический фиолетовый ) на закрепленный нагреванием мазок бактериальной культуры. Термофиксация убивает некоторые бактерии, но в основном используется для прикрепления бактерий к предметному стеклу, чтобы они не смывались во время процедуры окрашивания.
• Добавление йода , который связывается с кристаллическим фиолетовым и удерживает его в клетке.
• Быстрое обесцвечивание этанолом или ацетоном
• Контрастный с сафранином . Карболфуксин иногда заменяют сафранином, поскольку он более интенсивно окрашивает анаэробные бактерии, но его реже используют в качестве контрастного красителя.

Резюме окраски по Граму

Применение	Реагент	Цвет ячейки
		Грамположительный	Грамотрицательный
Первичный краситель	кристально-фиолетовый	фиолетовый	фиолетовый
едкий	йод	фиолетовый	фиолетовый
Обесцвечивающее средство	спирт / ацетон	фиолетовый	бесцветный
Счетчик пятен	сафранин / карбол фуксин	фиолетовый	розовый или красный

Кристаллический фиолетовый (CV) диссоциирует в водных растворах на CV +
и хлорид ( Cl —
) ионы. Эти ионы проникают через клеточную стенку как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. CV +
ion взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивает клетки в пурпурный цвет.

Йодид ( I —
или я —
3 ) взаимодействует с резюме +
и образует большие комплексы кристаллического фиолетового и йода (CV – I) во внутреннем и внешнем слоях клетки. Йод часто называют протравой , но он является улавливающим агентом, который предотвращает удаление комплекса CV – I и, следовательно, окрашивает клетку.

Когда добавляется обесцвечивающее средство, такое как спирт или ацетон, оно взаимодействует с липидами клеточной мембраны. Грамотрицательная клетка теряет свою внешнюю липополисахаридную мембрану, а внутренний пептидогликановый слой остается открытым. Комплексы CV – I вымываются из грамотрицательной клетки вместе с внешней мембраной. Напротив, грамположительные клетки обезвоживаются при обработке этанолом. Большие комплексы CV – I оказываются захваченными грамположительной клеткой из-за многослойной природы ее пептидогликана. Этап обесцвечивания имеет решающее значение и должен быть правильно рассчитан; окраска кристаллического фиолетового удаляется как с грамположительных, так и с отрицательных клеток, если обесцвечивающий агент остается на слишком долгое время (в течение нескольких секунд).

После обесцвечивания грамположительная клетка остается пурпурной, а грамотрицательная клетка теряет пурпурный цвет. Контркрашивание, которое обычно представляет собой положительно заряженный сафранин или основной фуксин, наносится в последнюю очередь, чтобы придать обесцвеченным грамотрицательным бактериям розовый или красный цвет. И грамположительные бактерии, и грамотрицательные бактерии улавливают контрастное пятно. Однако контрастное окрашивание не видно на грамположительных бактериях из-за более темного кристаллического фиолетового пятна.

Примеры

Грамположительные бактерии

Грамположительные бактерии обычно имеют единственную мембрану ( монодерму ), окруженную толстым пептидогликаном. Этому правилу следуют два типа: Firmicutes (за исключением классов Mollicutes и Negativicutes ) и Actinobacteria . Напротив, представители Chloroflexi (зеленые несернистые бактерии) являются монодермами, но обладают тонким или отсутствующим (класс Dehalococcoidetes ) пептидогликаном и могут окрашивать отрицательно, положительно или неопределенно; Члены Deinococcus-Thermus группы пятен являются положительными , но diderms с толстым пептидогликана.

Исторически грамположительные формы составляли тип Firmicutes — название, которое сейчас используется для самой большой группы. Он включает многие известные роды, такие как Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus и Clostridium . Он также был расширен за счет включения Mollicutes, бактерий, таких как Mycoplasma и Thermoplasma, которые не имеют клеточных стенок и поэтому не могут быть окрашены по Граму, но происходят из таких форм.

У некоторых бактерий есть клеточные стенки, которые особенно хорошо удерживают пятна. Они будут казаться положительными при окрашивании по Граму, даже если они не имеют близкого родства с другими грамположительными бактериями. Эти бактерии называются кислотоустойчивыми , и их можно отличить от других грамположительных бактерий только с помощью специальных процедур окрашивания .

Грамотрицательные бактерии

Грамотрицательные бактерии обычно обладают тонким слоем пептидогликана между двумя мембранами ( дидерм ). Липополисахарид (ЛПС) является наиболее распространенным антигеном на клеточной поверхности большинства грамотрицательных бактерий, составляя до 80% внешней мембраны E. coli и Salmonella . Большинство бактериальных типов являются грамотрицательными, включая цианобактерии , зеленые серные бактерии и большинство протеобактерий (за исключением некоторых представителей Rickettsiales и насекомых-эндосимбионтов Enterobacteriales ).

Грамотрицательные и грамотрицательные бактерии

Некоторые бактерии после окрашивания красителем по Граму дают картину с грамм-переменной: видна смесь розовых и пурпурных клеток. В культурах Bacillus, Butyrivibrio и Clostridium уменьшение толщины пептидогликана во время роста совпадает с увеличением количества клеток, окрашивающих грамотрицательные. Кроме того, у всех бактерий, окрашенных с помощью окрашивания по Граму, возраст культуры может влиять на результаты окрашивания.

Грамотрицательные бактерии не реагируют на окрашивание по Граму предсказуемо и, следовательно, не могут быть определены как грамположительные или грамотрицательные. Примеры включают многие виды Mycobacterium , включая Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae и Mycobacterium tuberculosis , последние два из которых являются возбудителями проказы и туберкулеза, соответственно. Бактерии рода Mycoplasma не имеют клеточной стенки вокруг своих клеточных мембран , что означает, что они не окрашиваются по методу Грама и устойчивы к антибиотикам, направленным на синтез клеточной стенки.

Орфографическое примечание

Термин « окрашивание по Граму» происходит от фамилии Ганса Христиана Грама ; эпоним (Gram) поэтому капитализируются , но не нарицательным (пятно) , как это обычно для научных терминов. Начальные буквы грамположительных и грамотрицательных , которые являются одноименными прилагательными , могут быть либо заглавными G, либо строчными буквами g , в зависимости от того, какое руководство по стилю (если оно есть) регулирует составляемый документ. Строчные буквы используются Центрами по контролю и профилактике заболеваний США и другими стилями, такими как стиль AMA . В словарях можно использовать строчные, прописные буквы или и то, и другое. Грамположительные или грамотрицательные символы в верхнем регистре также распространены во многих статьях и публикациях научных журналов . Когда статьи отправляются в журналы, каждый журнал может применять или не применять собственный стиль к постпринтной версии. Версии препринта содержат тот стиль, который использовал автор. Даже в режимах стиля, в которых прилагательные грамположительные и грамотрицательные используются строчными буквами, все же обычно используются заглавные буквы для окраски по Граму .

Источник