Методы исследования сахаролитических свойств бактерий
Изучение биохимических свойств фитопатогенных бактерий является обязательным при определении их родовой, видовой и типовой принадлежности. Для выявления и изучения этих свойств исследуемую культуру бактерий засевают на среды, в состав которых входят различные углеводы, белки и другие вещества. В некоторые из них вводят индикатор, который указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления и восстановления введенного в среду вещества.
Свойство расщеплять углеводы присуще многим фитопатогенным бактериям. Под действием сахаролитических ферментов этих бактерий углеводы расщепляются на альдегиды и кислоты с образованием в конечном итоге углекислоты и воды. Для обнаружения сахаролитических свойств исследуемую культуру бактерий засевают на специальные питательные среды, известные в лабораторной практике под названием «цветных» рядов. Для приготовления этих сред в качестве основы используют среду Гисса, синтетическую среду Омелянского и некоторые другие. В отделе фитопатогенных бактерий Института микробиологии и вирусологии АН УССР для этого применяется синтетическая среда Омелянского с добавлением в качестве индикатора бромтимол-бляу. Мясной бульон для этой цели не пригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к неправильным результатам.
Приводим методику приготовления среды Гисса: к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона, 0,5 г поваренной соли. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр так, чтобы раствор был совершенно прозрачный, устанавливают pH 7,0–7,4, прибавляют 0,5 г любого из применяемых углеводов, а также соответствующее количество одного из индикаторов – Андреде, бромтимол-бляу, лакмусовую настойку и др.
Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, предварительно простерилизованные вместе с поплавками, опущенными запаянными концами кверху. Среду стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или однократно 20 мин при 112° С. Во время стерилизации поплавки заполняются доверху питательной средой.
Посев фитопатогенных бактерий на среды Гисса производят односуточной культурой, снятой петлей с агарового косяка, либо бактериальной суспензией определенной плотности. После инкубации в термостате учитывают результаты ферментации углеводов на 2, 4, 7 и 10-й день, отмечая начало кислото- и газообразования. Образование кислоты или щелочи в пробирках сопровождается изменением цвета питательной среды и обозначается в зависимости от результатов буквой К (кислота) или буквой Щ (щелочь). Кислотообразование, сопровождающееся появлением пузырьков газов в поплавке обозначают буквами КГ. При длительном выдерживании посевов в термостате может произойти изменение кислой реакции среды в щелочную. Это объясняется использованием бактериями углерода аминокислот, выделением свободной аминогруппы, которая и дает нейтральную или слабощелочную реакцию.
В обычной практической работе для выявления сахаролитических свойств бактерий используют глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу и маннит. Однако результаты исследования фитопатогенных бактерий показывают, что иногда набор углеводов следует значительно расширить. В руководстве по микробиологическим методам, изданном обществом американских бактериологов (1957), рекомендуется использовать следующие углеводы, спирты и глюкозиды.
Источник
Методы изучения ферментативной активности.
В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.
Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:
Ø среды Гисса (пестрый ряд):
v жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;
v полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;
v короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);
v длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).
Ø среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.
Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.
Ø среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным соответственно.
У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными.
Для определения протеолитических ферментов используют:
Ø определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак);
Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:
v индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;
v H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;
v о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.
Ø способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);
Ø способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.
Источник
Сахаролитические свойства микроорганизмов
Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим патогенным микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества: СO2 и Н2.
Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, остаются нейтральными в отношении глюкозы, другие, наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызывают расщепление и глюкозы, и лактозы.
Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Другими словами, есть «большой» и «малый» «пестрый ряд».
Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и, соответственно, цвет питательной среды.
Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубочку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.
В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности.
Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов.
Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуемой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.
Дата добавления: 2014-12-06 ; просмотров: 10818 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
Источник
Методы изучения ферментативной активности бактерий
Ферменты бактерий.
Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками.
Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:
— 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;
— 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим;
— 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды;
— 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;
— 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;
— 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений.
Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты.
Эндоферментыкатализируют процессы внутри клетки. Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Это ферменты: а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий;
— гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту;
— дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;
— фибринолизин – расщепляет коллаген;
— плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;
— нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;
— лецитовителлаза – расщепляет лецитин.
Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.
Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).
Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.
Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.
Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки — протеолитическими свойствами.
Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО2 или Н2 ), а при распаде белков — образование щелочей, H2S, NH3.
Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.
Изучение сахаролитических свойств.
Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева,а такжежидкие и полужидкие среды Гисса.
Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактозу и определенный индикатор.
Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки — E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо — красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.
Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.
Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.
Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.
Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды — розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.
Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается «пестрый ряд». Каждый вид бактерий характеризуется своим «пестрым рядом».
Изучение протеолитических свойств.
Протеолитические свойства бактерий изучают:
а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент — коллагеназа;
б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н2S, NH3.
Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола — щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н2S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH3 – лакмусовая бумажка (синий цвет).
Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.
Источник
