Мембранный потенциал. Методы измерения мембранного потенциала. Микроэлектродная техника.
Метод фиксации потенциала. В данном методе используют электронную систему с обратной связью, которая обеспечивает автоматическое поддержание мембранного потенциала. Разность потенциалов по разные стороны мембраны фиксируют на определенном уровне, при этом мембранный потенциал можно ступенчато изменять на строго определенную величину. Такой метод позволяет измерить ионные токи, протекающие сквозь мембрану через каналы, которые активируются при изменении потенциала.
Метод фиксации напряжения позволяет измерять ионный поток при перемещении иона по контролируемому градиенту электрохимического потенциала и получать информацию об электрической проводимости мембраны и её пассивной проницаемости в отношении интересующего нас иона.
Метод пэтч-кламп применяется стеклянная микропипетка со сглаженными краями диаметром около 1 мкм вместо «острых» микроэлектродов. Пипетка наполняется раствором, в зависимости от конкретного исследования или метода пэтч-кламп. Контактирующий с этим раствором металлический электрод передает изменения заряда на усилитель мембранного потенциала Он прижимается к клеточной мембране, после чего мембрана всасывается внутрь пипетки с электродом, образуя электронепроницаемую «гигаомическую» изоляцию. При данном методе один-единственный электрод используется для фиксации потенциала клеточной мембраны, за счет чего напряжение сохраняется на постоянном уровне, в то время как регистрируются изменения тока. Аналогично, может быть использован токопроводящий зажим для записи изменений напряжения.
Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта. Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концентрацией ионов кальция. Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной ёмкостью держателя и стенок.
Гигантский аксон кальмара, диаметром 0,5мм. Можно ввести микроэлектрод не нанося повреждений. Микроэлектрод стеклянный – микропипетка с тонким кончиком. Металлический электрод не может проколоть мембрану. Для исключения поляризации электрода используют неполяризационные электроды – серебряная проволока покрытая AgCl, в растворе KCl или NaCl (заполняют электрод). Второй электрод (сравнение) расположен у наружной поверхности клетки. Регистрирующее устройство (с усилителем постоянного тока) измеряет мембранный потенциал.
29. Возникновение потенциала покоя. Гипотеза Бернштейна. Уравнение Нернста. Уравнение Гольдмана – Ходжами – Катца. Эквивалентная электрическая схема мембраны.
Для описания изменений мембранного потенциала при возбуждении часто используют и другой подход, основанный на представлении ионных проводимостей мембраны в виде эквивалентной электрической цепи
|
о
Мембранный потенциал, измеряемый на схеме между точками i и о, создается электродвижущими силами, равными равновесными потенциалами отдельных видов ионов, последовательно соединенных с соответствующими сопротивлениями. Ток в каждой из ветвей равен:
Где gi – проводимость мембраны для данного вида ионов, ji – равновесный потенциал данного вида ионов, а j — общий потенциал на мембране. Используя условие, что в разомкнутой цепи при постоянном напряжении на мембране сумма токов равна нулю, можно получить следующее выражение для мембранного потенциала:
, (4)
где gM – суммарная проводимость мембраны: gM = gK + gNa + gCl.
Из (4) видно, что значение мембранного потенциала определяется теми ионами, для которых проводимость максимальна.
Эквивалентная схема ионных проводимостей мембраны и основанное на ней уравнение (4) предполагают, что разные виды ионов проникают через клеточную мембрану по пространственно разделённым путям.
Источник
Регистрация потенциала покоя
Мембранный потенциал покоя
Kогда клетка находится [Б30] в состоянии физиологического покоя, ее внутренний потенциал, отрицателен по отношению к наружному, условно принимаемому за нуль[Б31] . Этот потенциал называют потенциалом покоя (мембранным потенциалом покоя, трансмембранным потенциалом покоя).
Довольно часто термин «мембранный потенциал» используют как синоним термина «потенциал покоя»[Б32] . На наш взгляд, это недопустимо, поскольку термин «мембранный потенциал» просто необходим для обозначения любого значения трансмембранной разницы потенциала, наблюдаемое как в состоянии покоя клетки, так и при возбуждении, в любое время и в любом состоянии[Б33] .
Как можно обнаружить мембранный потенциал покоя?
1. методом повреждения
2. методом внутриклеточного отведения (рис. ).
Рис. . Методы регистрации мембранного потенциала покоя: слева – метод повреждения, справа – метод внутриклеточного отведения[Б34] .
Студенты на этот вопрос часто отвечают так: методами внутриклеточного и внеклеточного отведения. Типичная ошибка! Методом внеклеточного отведения можно зарегистрировать возбуждение участка мембраны, сравнив его потенциал с потенциалом мембраны в состоянии покоя, но не потенциал покоя. Но об этом позже.
Метод повреждения чаще используется при регистрации потенциала покоя на макропрепарате – мышце, нерве (рис. ).
Рис. . Схема регистрации мембранного потенциала покоя методом повреждения на макропрепарате.
Впервые таким способом регистрировали потенциал покоя в середине XIX века Дюбуа-Реймон (на срезе нерва[Б35] ) и Маттеучи (на срезе мышцы). Этот же метод лежит в основе второго опыта Гальвани[Б36] , в этом случае мышечно-нервный препарат выполняет роль регистрирующего прибора.
Методом повреждения достаточно точно измерить потенциал покоя невозможно.
Чтобы измерить потенциал покоя и тем более проследить его изменения, вызываемые каким-либо воздействием на клетку, применяют технику внутриклеточных микроэлектродов (рис. ).
Рис. . Схема измерения потенциала покоя клетки с помощью внутриклеточного электрода.
К – объект исследования – клетка, М – микроэлектрод, И – индифферентный электрод, Р – регистрирующее устройство. Момент прокола на кривой «разность потенциалов – время» показан стрелкой.
Микроэлектрод представляет собой микропипетку, т.е. тонкий капилляр, вытянутый из стеклянной трубочки. Диаметр его кончика около 0,5 мкм[Б37] . Микропипетку заполняют солевым раствором (обычно 3 М KС1), погружают в него металлический электрод (хлорированную серебряную проволочку) и соединяют с электроизмерительным прибором[Б38] , снабженным усилителем постоянного тока[Б39] .
Микроэлектрод устанавливают над исследуемым объектом, например скелетной мышцей, а затем при помощи микроманипулятора — прибора, снабженного микрометрическими винтами, вводят внутрь клетки[Б40] . При удачном введении микроэлектрода мембрана плотно охватывает его кончик и клетка сохраняет способность функционировать в течение нескольких часов, не проявляя признаков повреждения[Б41] .
Микроэлектрод является активным (референтным). Электрод сравнения (индифферентный) обычных размеров погружают в нормальный солевой раствор, в котором находится исследуемая ткань[Б42] .
До прокола мембраны микроэлектродом разность потенциалов между активным и индифферентным электродом равна нулю (рис. и рис. А). Kак только микроэлектрод прокалывает поверхностную мембрану клетки, регистрируется разность потенциалов между поверхностью и содержимым клетки, равная потенциалу покоя клетки[Б43] . На рис. показано, что продвижение микроэлектрода внутри протоплазмы (рис. B, C, D) или изменение положения электрода внутри клетки (рис. E) на показаниях вольтметра не сказываются[Б44] . После прокола (рис. F) микроэлектродом мембраны на противоположной стенке клетки от входа в клетку электрода разность потенциалов вновь не регистрируется. Это свидетельствует о том, что разница потенциал действительно определяется между цитоплазмой и окружающим клетку наружным раствором[Б45] .
[Б47] Рис. . Результаты измерения разности потенциала микроэлектродным методом при разном расположении активного электрода.
У различных клеток мембранный потенциал покоя варьирует от –50 до –90 мВ[Б48] .
Источник
Мембранный потенциал. Определение. Величина. Микроэлектродный метод измерения МП.
Одна из важнейших функций биологической мембраны — генерация и передача биопотенциалов. Это явление лежит в основе возбудимости клеток, регуляции внутриклеточных процессов, работы нервной системы, регуляции мышечного сокращения, рецепции.
Мембранный потенциал — разность потенциалов между внутренней (цитоплазматической) и наружной поверхностями мембраны живой клетки в состоянии физиологического покоя. Внешняя поверхность клетки несет положительный заряд, а внутренняя сторона мембраны (цитоплазма) – отрицательный. ∆φ= φвн- φнар
Величина МП=-60-90 мВ. Мембранные потенциалы подразделяются на потенциалы покоя и потенциалы действия.
Потенциал покояприсущ как невозбудимым клеткам (например, эритроциту), так и возбудимым (аксоны, кардиомиоциты). Потенциалы действия существуют только в возбудимых клетках и тканях. 
Мембранный потенциал покоя образуется за счёт двух процессов: 1. Работа калий-натриевого насоса мембраны. Работа калий-натриевого насоса, в свою очередь, имеет 2 следствия: 1.1. Непосредственное электрогенное (порождающее электрические явления) действие ионного насоса-обменника. Это создание небольшой электроотрицательности внутри клетки (-10 мВ). Виноват в этом неравный обмен натрия на калий. Натрия выбрасывается из клетки больше, чем поступает в обмен калия. А вместе с натрием удаляется и больше «плюсиков» (положительных зарядов), чем возвращается вместе с калием. Возникает небольшой дефицит положительных зарядов. Мембрана изнутри заряжается отрицательно (примерно -10 мВ).
1.2. Создание предпосылок для возникновения большой электроотрицательности. Эти предпосылки — неравная концентрация ионов калия внутри и снаружи клетки. Лишний калий готов выходить из клетки и выносить из неё положительные заряды. Об этом мы скажем сейчас ниже. 2. Утечка ионов калия из клетки. Из зоны повышенной концентрации внутри клетки ионы калия выходят в зону пониженной концентрации наружу, вынося заодно положительные электрические заряды. Возникает сильный дефицит положительных зарядов внутри клетки. В итоге мембрана дополнительно заряжается изнутри отрицательно (до -70 мВ). 
Вывод: Калий-натриевый насос создает предпосылки для возникновения потенциала покоя. Это — разность в концентрации ионов между внутренней и наружной средой клетки. Отдельно проявляет себя разность концентрации по натрию и разность концентрации по калию. Попытка клетки выровнять концентрацию ионов по калию приводит к потере калия, потере положительных зарядов и порождает электроотрицательность внутри клетки. Эта электро отрицательность составляет большую часть потенциала покоя. Меньшую его часть составляет непосредственная электрогенность ионного насоса, т.е. преобладающие потери натрия при его обмене на калий.
Микроэлектродный метод измерения биопотенциалов. Микроэлектроды бывают металлическими и стеклянными. Металлический микроэлектрод представляет собой стержень из специальной высокоомной изолированной проволоки с регистрирующим кончиком. Стеклянный микроэлектрод диаметром около 1 мм изготавливается из специального стекла — пирекса, с тонким незапаянным кончиком, заполненным раствором электролита. Схема регистрации мембранного потенциала. Микроэлектроды подводят к изучаемым отделам головного мозга, отвечающих за память у животных, и наблюдают графическую запись импульсной активности нейронов.
Микроэлектродный метод дал возможность измерить биопотенциалы не только на гигантском аксоне кальмара, но и на клетках нормальных размеров: нервных волокнах других животных, клетках скелетных мышц, клетках миокарда и других.
В медицине на исследование электрических полей, созданных биопотенциалами органов и тканей, основаны диагностические методы: электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография и другие. Практикуется и лечебное воздействие на ткани и органы внешними электрическими импульсами при электростимуляции.
II.
Регистрация кривой порога слышимости
Изучение аппарата для измерения артериального давления
Снятие электрокардиограммы и построение вектора ЭДС сердца
Источник
