Способ фиксации мазка микробиология

Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см 2 . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации — обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, — основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Источник

Способ фиксации мазка микробиология

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Рис. 11-8. Приготовление мазков из материала с тампонов (А) и непрозрачных жидкостей (Б)

Окрашенные мазки. Отбор материала для микроскопии

Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 11-8, А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 11-8, Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят растиранием их между двумя предметными стёклами (рис. 11-9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 11-10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной палочки (рис. 11-10, Б).

Рис. 11-9. Приготовление мазков из материала со слизистой оболочки или грубой консистенцией.

Фиксация препарата. Фиксация мазка. Фиксация бактерий

В практической бактериологии наиболее распространена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к красителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путём химического их сшивания. Для светоопти-ческой микроскопии используют формалин, спирты, глутараль-дегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др.

Рис. 11-10. Приготовление мазков из прозрачных жидкостей (А) и из осадка после центрифугирования (Б).

Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

Источник

6.2. Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде

Тела микробных клеток в преобладающем большинстве слу­чаев прозрачны и для того, чтобы увидеть четкие контуры микробных клеток, применяют метод биологического окраши­вания.

Окрашенные тела микроорганизмов, отчетливо выделяясь на серебристо-белом фоне препарата, позволяют ориентиро­вочно оценивать состав микробного пейзажа, изучаемого объ­екта; при применении специальных методов окраски исследу­ют некоторые анатомические структуры клетки: наличие кап­сул, спор, жгутиков, ядерного вещества, мембраны и т. д.

В качестве основных красок в микробиологии используют производные каменноугольной смолы, главным образом искус­ственные органические красители, получаемые из анилина (С₆Н₅NН₂,), его производных и других ароматических аминов, ряда нафталина и антрацена.

В зависимости от химической природы эти красители под­разделяются на две группы: катионные, обладающие свойства­ми оснований, и анионные (кислые). Соответственно этому они окрашивают противоположно заряженные структуры кле­ток. Так, например, ядерная ДНК клеток, относящаяся к кис­лым субстратам, будет окрашиваться катионными красками: кристаллметилвиолетом или сафранином, а цитоплазма клет­ки, обладающая щелочной реакцией, – кислыми красителями: фуксином, пикриновой кислотой и другими анионными крас­ками.

В табл. 6.1 представлены наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп.

Таблица 6.1. Наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп

Нигрозин (индийские чернила)

Из сухих анилиновых красок готовят обычно насыщенные спиртовые растворы, которые, не изменяя своих свойств, могут храниться длительное время. Из насыщенных спиртовых рас­творов для окрашивания бактерий изготавливаются рабочие, разбавленные спиртовые растворы нужной концентрации.

Для окрашивания микроорганизмов пользуются преимуще­ственно основными красителями.

6.2.1. Приготовление мазков для окрашивания

Мазки готовят из культур микробов, клинического материа­ла (мокрота, гной, моча, кровь и др.), из биоптатов, органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером ис­следуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (осадка центрифугированной мочи, ликвора и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериологической петлей на предметное стекло и круговыми движениями последней распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром с копеечную монету (рис. 6.2). Мазки должны содержать достаточно материала для полноценного исследования, но не должны быть чрезмерно толстыми, так как во время окрашивания они могут набухать и содержащиеся в них клетки
   невозможно будет дифференцировать.
2. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе – шлифованное – стекло, которое должно быть уже предметно­го, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую ок­раску и одинаковую толщину на всем протяжении.
3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериологической петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, обра­зуя неровный край.

1. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). При изготовлении мазков из мокроты для микроскопии следует выбирать участки, содержащие гнойные комочки, в Которых с наибольшей вероятностью содержится этиологичес­кий агент. Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу. После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны; при движении оба стекла должны плотно прилегать друг к другу (рис. 6.3). Полу­чаются мазки с равномерно распределенным материалом, за­нимающим большую часть предметного стекла.
2. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого хорошо обезжиренного стекла нано­сят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериологичес­кой петлей небольшое количество исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1).
3. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стекла­ми. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабли­вании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериологической петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу последовательно в нескольких участках, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.

1. Приготовление мазков из слизистого отделяемого носоглот­ки, полости рта, носа и влагалища. Мазки с тампонов готовят посредством прокатывания тампона по предметному стеклу. Этот метод аппликации помогает сохранить морфологию и расположение клеток хозяина на участке, с которого получен материал.

6.2.2. Высушивание и фиксирование мазков

Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фик­сировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата мик­робные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие примене­ние химических средств, вызывающих коагуляцию белков ци­топлазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препара­том берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за реб­ра мазком кверху и плавным движением проводят 2–3 ра­за над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фикса­ции должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков приме­няют также химические вещества и соединения (табл. 6.2).

Таблица 6.2. Химические вещества и соединения, применяемые для фиксации мазков

Источник

3. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые мето­ды окраски.

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов: а) бактериологический мазок (препарат-мазок); б) «висячая капля»; в) «придавленная капля»; г) тонкий мазок; д)»толстая капля»; ж) препарат-отпечаток.

Этапы приготовления фиксированного мазка.

Приготовление препаратов для микроскопического иссле­дования.

Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.

Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель — в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внут­реннюю поверхность, после чего легким скользящим движе­нием берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой. После при­готовления препарата петлю обязательно прожигают (стерили­зуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1—1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непо­средственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого возду­ха над пламенем горелки.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур, м/озмов фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Простые методы окраски мазков

Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

4. Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски.

Сложные методы. Включают последовательное нане­сение на препарат красителей, различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

1. По Леффлеру— гранулы валютина окрашиваются в темно- синий, а палочка дифтерийной каринобактерии в голубой.

2. По Нейсеру— валютин в сине-черный, а бактерия в желтый.

3. По Гинсу-Бурри— обнаружение капсул

4. По Шефферу— Фультону- окрашивание спор ( существует еще способ Пешкова).

5. Окраска по Цилю- Нельсену. Применяется для выявления кислото- и спиртоустойчивых микобактерий туберкулеза, лепры и некоторых актиномицетов, которые из-за большого количества в клеточных оболочках липилов, воска и оксикислот непроницаемы дл: разведенных растворов красителей. Окрашивание их достигается, при помощи фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.Кислоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, — в светло-синий цвет.

6. Окраска по Романовскому-Гимзе Осуществляется сложным красителем (в его состав входят метиленовый синий, эозин и азур), в результате он окрашивает бактерии (спирохеты), простейшие и форменные -элементы крови в различные цвета и оттенки. Так, под его воздействием цитоплазма простейших приобретает голубой цвет, а ядра — красный: боррелии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а трепонемы и лептоспиры — в слабо-розовый; эритроциты — в розовый цвет, ядра лейкоцитов — в фиолетовый, а их цитоплазма — в голубой (базофильная зернистость — в синий, эозинофильная — н красный, нейтрофильная — в сиреневый).

7. Окраска по Граму.

Из-за неодинакового содержания пептидогликана (ПГ) в оболочках разных прокариот метод дает возможность подразделять их на грамположительные (фиолетовые, 90 % ПГ) и грамотрицательные (розовые, 5-20 % ПГ) В соответствии с этим, во-первых, в царстве прокариот выделяют четыре раздела: 1. тонкостенные, грамотрицательные. 2. толстостенные, грамположительные. 3. лишенные стенок. 4. дефектные стенки, отсутствие пептидогликана. Во-вторых, окраска по Граму позволяет также установить родовую и видовую принадлежность многих возбудителей инфекционных болезней. Например, известно, что все болезнетворные кокки (кроме гонококка и менингококка), бациллы и клостридии являются грамположительными. а энтеробактерии, вибрионы, трепонемы — грамотрицательными.

Техника окраски по Граму:

Наносим на фиксированный мазок через фильтровальную бумажку раствор генцианвиолетта на 2-3 минуты. У грам+ м/о генцианвиолет проникает вглубь клеточной стенки и образует прочный комплекс с трихоевыми кислотами и Mgниевыми солями РНК, у грам- краситель проникает в в клеточную стенку.

Промываем водой – для удаления излишков красителя

Наносим раствор Люголя на 1 минуту – для удаления остатков влаги и укрепления образовавшейся связи у грам+.

Сливаем, не промывая водой.

Наносим раствор этилового 96% спирта на 30 секунд, равномерно покачиваем для отхождения фиолетовых пятен. Из грам- вымывается краситель.

Промыть под водой

Наносим раствор фуксина на 2-3 минуты для окраски обесцветившихся грам- м/о

Источник